核桃青皮提取物联合顺铂对Lewis肺癌细胞的诱导凋亡作用

王 爽 于洪泉 温 娜 纪鹏艳 金 宏 王玮瑶 曹志友

(吉林医药学院医学实验中心，吉林 吉林 132013)

肺癌的发生与多种致病因素有关，化疗在肺癌的治疗中始终占有重要的地位。但由于化疗药物用量大，副作用多，很多患者难以忍受。现代中药研究表明，很多中药成分都具有抗肿瘤作用，因此，人们对中药抗肿瘤的研究越来越多。核桃青皮是民间密方白桃汤剂中的主要成分，故本实验拟研究核桃青皮提取物诱导Lewis肺癌细胞凋亡的作用，为该药抗肿瘤作用提供初步的理论依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂 DMEM培养基(Hyclone公司)，小牛血清和胰蛋白酶(Gibco公司)，核桃青皮粉剂(吉林医药学院自制)，四甲基偶氮唑(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)和顺铂(美国Sigma公司)。

1.2Lewis肺癌细胞的培养 从液氮中取出冻存的Lewis肺癌细胞，37℃水浴振荡至融解，然后将细胞接种于75 cm2培养瓶中，加入10 ml含10%小牛血清的DMEM细胞培养液，将其置入37℃、5%CO2和饱和湿度培养箱中进行培养，隔日换液。

1.3MTT法检测药物对Lewis肺癌细胞的诱导凋亡作用 称取适量核桃青皮提取物，加入含5%小牛血清RPMI-1640细胞培养液，配制成终浓度为0、1、2和4 μg/L的含药培养基。将细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为8×104/ml，将96孔板加入细胞悬液，每孔100 μl，置入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养过夜。加入含药培养基，每个药物浓度重复5次。分别于30 min、3、12、24 h终止反应，每孔加入MTT 20 μl，37℃孵育4 h，弃去上清液，每孔加入150 μl DMSO，摇床震荡均匀使MTT沉淀完全溶解，15 min后在酶联免疫检测仪上490 nm波长处测定各孔吸光度(A)值，用不加细胞的空白孔调零。

2 结 果

2.1不同浓度核桃青皮提取物对Lewis肺癌细胞的诱导凋亡作用 核桃青皮提取物在作用Lewis肺癌细胞30 min、3 h、12 h和24 h，主要表现为对细胞的诱导凋亡作用。30 min时各药物浓度组细胞生长并未表现出明显的作用；3 h时各药物浓度组细胞凋亡开始出现，以4 μg/L浓度组最明显，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；12 h时各药物浓度组细胞凋亡2和4 μg/L浓度组最明显，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；24 h时各药物浓度组细胞凋亡在1、2和4 μg/L浓度组明显，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.001)。见图1。

2.2核桃青皮提取物联合顺铂对Lewis肺癌细胞的诱导凋亡作用 0、1、2和4 μg/L核桃青皮提取物联合顺铂作用Lewis肺癌细胞24 h，联合用药组细胞均明显发生凋亡；与单独应用核桃青皮提取物组比较，2、4 μg/L浓度组细胞凋亡更加明显(P<0.05或P<0.01)。见图2。

与0 μg/L组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

与未加顺铂组相比：1)P<0.05，2)P<0.01

3 讨 论

自1972年Kerr等提出细胞凋亡的概念以来，学者们已逐渐认识到肿瘤与凋亡的相关性〔1〕。促使肿瘤凋亡这种治疗方式可以有效地保护人体正常细胞，对人体安全而无副作用。因此，凋亡现已成为抗肿瘤研究的热点内容之一。

核桃青皮是民间抗肿瘤常用的药物之一。研究人员发现，核桃青皮提取物具有抗肿瘤作用。核桃青皮水提物抑制小鼠肉瘤S180和小鼠实体型肝癌的生长，并与所用剂量呈现一定的依赖关系〔2〕；核桃楸青皮水提物对机体有一定的免疫调节作用，可以降低小鼠体内脂质过氧化程度〔3，4〕。而从青核桃中分离出的物质可以直接杀死体外培养的S180癌细胞，作用呈浓度时间依赖性〔5〕。

此前研究表明，核桃青皮提取物可以抑制肿瘤的体内生长〔6〕，但机制不清。本实验进一步研究核桃青皮提取物诱导肺癌细胞凋亡的作用，由于核桃青皮具有一定的毒性作用，本实验使用低剂量的核桃青皮提取物，将小鼠Lewis肺癌细胞经低浓度核桃青皮提取物作用后，细胞明显出现凋亡，并具有时显的时间-剂量效应关系。联合常用化疗药物顺铂后，细胞均明显发生凋亡；与单独应用核桃青皮提取物组比较，肿瘤细胞凋亡更加明显。说明核桃青皮提取物具有促进细胞凋亡的作用，与铂类化疗药中常用的顺铂有协同作用。但其对细胞的毒性作用还需进一步研究。

4 参考文献

1吴海星,侯晓节,徐希妮,等.五味子乙素抗肿瘤的多种作用机制〔J〕.吉林医药学院学报，2012；33(2):107-10.

2王绍林,王绍东,刘今方.核桃楸青果皮的生药鉴别和抗肿瘤作用研究〔J〕.药学实践杂志,1995；13(1):40-2.

3兰 英,赵 锐.核桃楸青果皮水提物对降低小鼠体内丙二醛质量浓度的研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版),2000；6(1):476-7.

4兰 英,房金波,张维晶,等.核桃楸青果皮(GPJM)水提物诱生小鼠肿瘤坏死因子的实脸研究〔J〕.东北师范大学学报(自然科学版),2003；35(1):78-81.

5刘瑞梅.青核桃及刺五加抗癌作用的药理研究〔J〕.中草药,1980；11(7):213-4.

6曹志友,欧阳瑾,温 娜,等.核桃青皮提取物对小鼠Lewis肺癌细胞生长的抑制作用〔J〕.中国实验诊断学,2012；16(2):232-3.