人参二醇组皂苷改善内毒素诱导急性肾损伤小鼠肾功能的机制

陈 燕 孟 艳 杜艳伟 于 淇 王晓琴 付 双 刘莲勤 方 圆 赵雪俭

(吉林大学基础医学院病理生理教研室，吉林 长春 130021)

脓毒血症诱发的失控性全身性炎症反应综合征(SIRS)是导致多器官衰竭的重要原因，而急性肾损伤(AKI)是其中最严重的并发症，致死率极高〔1～3〕。脓毒血症发生时内毒素(LPS)直接与内皮细胞和白细胞结合，刺激大量细胞因子及自由基的产生和释放，诱发炎症级联反应〔4〕。此过程中，肾脏是受累的主要器官，氧化应激在LPS诱导的AKI中起重要作用。本实验拟探讨人参二醇组皂苷(PDS)改善LPS诱导AKI小鼠肾功能的可能机制。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 C57BL/6小鼠由吉林大学实验动物中心提供。实验方案通过吉林大学动物伦理审查委员会审核批准。

1.1.2药物 PDS由吉林大学天然药物研究室提供，专利号ZL 98 100070.3，使用时用生理盐水配制。

1.2方法

1.2.1AKI小鼠模型的构建 24只雄性C57BL/6小鼠，随机分为如下3组(n=8)：对照组、LPS组、PDS+LPS组。对照组经腹腔注射0.5 ml 0.9%氯化钠。LPS组、PDS+LPS组小鼠分别经腹腔注射LPS 10 mg/kg (大肠杆菌血清型O111：B4，购于英国Sigma公司)。PDS+LPS组小鼠在LPS注射前1 h经腹腔注射PDS(25.0 mg/kg)。脂多糖注射12 h, 戊巴比妥将小鼠深度麻醉后, 取肾脏冻存或固定，备蛋白表达与形态学观察用，并收集血液用于生化检测。

1.2.2小鼠肾脏组织HE染色 给予PDS预保护1 h后注射LPS 12 h之后，将各组小鼠处死，并分离肾脏组织，通过HE染色的方法观察各组肾脏组织形态学变化。

1.2.3TUNEL法检测肾脏细胞凋亡 按TUNEL试剂盒(DeadEndTM荧光测定系统购于美国Promega公司)说明书操作，检测肾脏细胞凋亡情况，以肾脏组织出现棕褐色、且着色强度高于背景非特异性染色者判定为阳性。

1.2.4全自动生化分析仪检测血液生化指标 小鼠的血清样品离心(3 000 r/min，10 min)，利用诊断试剂盒(均购于南京建成生物科技公司)与全自动生化分析仪(美国，Beckman Coulter LX20)检测：肾功能标志物〔肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)〕、肝功能标志物〔谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)〕。

1.2.5Western印迹方法检测蛋白表达 将50～100 mg的肾脏组织用液氮研磨成粉末并移至EP管中。将500～800 μl组织裂解液RIPA(含PMSF和蛋白酶抑制剂，购于碧云天公司)加入盛有肾组织粉末的EP管内，于冰上孵育10 min，室温放置10 min，4℃，12 000 r/min，离心20 min。用微量移液器吸取上清后分装，保存于-80℃。按照常规方法配制聚丙烯酰胺凝胶，依次进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、抗体孵育、ECL显色。特异性条带用上海天能科技有限公司GIS凝胶图像分析系统进行灰度扫描。

1.2.6检测肾组织中一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性 肾组织NO含量检测采用硝酸还原酶法测定，MDA含量检测采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定，用SOD测定试剂盒检测肾脏SOD活性；分别用分光光度计在550 nm、535 nm、550 nm处读数(以上检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所)。

1.2.7检测肾组织一氧化氮合成酶(iNOS)及Mn-SOD蛋白表达 应用免疫印迹方法检测肾组织iNOS及Mn-SOD蛋白表达(抗体均购于Abcam，Cambridge，MA，USA)。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 结 果

2.1HE染色显示各组肾脏组织形态学变化 LPS组肾小管上皮细胞肿胀、管腔缩小、肾间质水肿，有炎细胞浸润；PDS+LPS组与LPS组比较，上述表现明显减轻。见图1。

2.2各组小鼠肾脏组织凋亡情况 应用TUNEL方法检测可见肾脏组织细胞中有棕褐色深染颗粒，说明有细胞凋亡。见图2。并且LPS组凋亡程度严重，PDS+LPS组凋亡程度较LPS组减轻。

图1 肾脏组织形态学变化(HE染色,×100)

图2 TUNEL法检测肾脏组织凋亡(×200)

2.3PDS对肾功能的影响 血清BUN含量 LPS组〔(32.31±1.76)mmol/L〕明显高于对照组〔(11.83±0.99)mmol/L〕(P<0.01)，而PDS+LPS组的BUN含量〔(24.95±2.61)mmol/L〕显著地低于LPS组(P<0.05)。血清的CREA含量以LPS组为最高〔(44.15±2.87)μmol/L〕，与对照组〔(16.16±1.43)μmol/L〕比较差异极为显著(P<0.01)，PDS+LPS组〔(32.60±2.80)μmol/L〕明显低于LPS组(P<0.05)。

2.4PDS对肝功能的影响 血清ALT活性，LPS组〔(73.29±4.00)IU/L〕与对照组〔(36.37±3.61)IU/L〕比较显著增高(P<0.01)，PDS+LPS组ATL活性〔(70.09±5.25)IU/L〕与LPS组比较仅有下降趋势。血清AST水平，LPS组〔(273.14±32.85)IU/L〕极显著高于对照组〔(90.50±7.53)IU/L〕(P<0.01),PDS+LPS组〔(181.00±16.54)IU/L〕与LPS组比较明显降低(P<0.05)。

2.5PDS对氧化应激相关指标的影响 LPS诱导AKI小鼠肾组织NO水平急剧增加。LPS组iNOS蛋白表达水平和NO含量与对照组比较明显增加(P<0.01，P<0.05)，PDS+LPS组iNOS蛋白表达水平和NO含量均显著低于LPS组(P<0.05)。LPS组肾脏MDA含量与对照组比较明显增高(P<0.05)，SOD含量和Mn-SOD的蛋白表达水平都明显低于对照组(P<0.01，P<0.05)。见图3，图4。

图3 PDS对LPS诱导AKI小鼠肾脏NO、mDA含量及SOD活性、Mn-SOD、iNOS表达水平的影响

1.对照组；2.LP组；3.PDS+LPS组

3 讨 论

在脓毒血症致病过程中，活性氧(ROS)主要通过以下途径产生毒性作用：引起脂质过氧化、激活凋亡通路、调整细胞内钙浓度、诱导黏附因子表达。氧化应激也可以造成线粒体膜通透性增加，这会导致线粒体内剩余的NAD+减少并伴随其他基团的产生。超氧化物和NO除了有致病作用，在正常的肾脏和血管中也发挥着生理功能〔5〕。研究表明，在实验性脓毒血症AKI的肾损伤是潜在的、可逆的，早期的抗炎和抗氧化剂治疗可以改善肾功能〔6〕。

本研究结果说明LPS(10 mg/kg)腹腔注射12 h不仅诱导出AKI，也导致了心、肝等多脏器的损伤；PDS有逆转多脏器功能损伤的作用。

脓毒血症性AKI的发病源于对促炎因子的反应，包括细胞因子分泌和活性氮氧化物(RNOS)〔7〕。肾组织氧供除了用于线粒体的呼吸作用，还用于产生ROS和NO。除了有直接的舒血管作用外，经内皮细胞iNOS生成的NO还通过内源的抗炎作用，阻止血管发生功能障碍。正如发生在缺血再灌注损伤和败血症时的情形，消耗iNOS相应的辅酶因子会释放内皮细胞上的iNOS，进而增强ROS的产量〔8〕。细胞产生的过多的NO可以通过竞争氧气在线粒体中的细胞色素氧化酶抑制线粒体的呼吸作用，这种竞争呈剂量依赖性〔9,10〕。在正常情况下，活性氧被少量释放并且被内生的抗氧化剂所拮抗，避免氧化应激给组织带来损伤。氧化应激通常会导致肾细胞通过凋亡通路变性。凋亡诱发的氧化应激和进行性的线粒体功能紊乱是诱发肾病机制的基石。几项研究共同表明，在急性、慢性肾病的细胞损伤中针对活性氧方面会对设计未来的治疗方法有帮助。

Holthoff等〔11〕研究表明，白藜芦醇通过抑制活性氮自由基(RNS)的活性实现了保护败血症性AKI的作用〔12〕。Wu等〔7,12〕研究显示选择性iNOS抑制剂(L-N6-(1-Iminoethyl)lysine，L-NIL)减轻了肾小管的氧化应激，并纠正了微循环的异常。本研究发现PDS通过抑制肾脏iNOS表达，减少NO产生与释放，改善了LPS诱导AKI小鼠的肾功能。MDA是脂质过氧化反应生成的另一种氧化应激的标志物，是氧化强化剂，在其作用下，大量的自由基能损伤DNA、RNA、蛋白质和脂质复合体，而且还会引发突变及凋亡的发生。组织MDA水平可代表组织的氧化应激水平，本研究发现LPS组肾脏MDA含量与对照组比较明显增高，而PDS+LPS组与LPS组比较MDA水平明显减少。SOD为清除氧自由基的主要酶，而Mn-SOD为线粒体特异的捕捉氧自由基的酶，本研究发现LPS组SOD含量和Mn-SOD的蛋白表达水平都明显低于对照组。而PDS+LPS组SOD含量和Mn-SOD的蛋白表达水平都明显高于LPS组，说明LPS诱导的氧化应激加重AKI小鼠的肾脏功能障碍，给予PDS通过抑制MDA的产生和上调SOD的表达和活性起到了抗氧化应激损伤，保护LPS诱导的AKI肾脏功能的作用。

PDS是从人参茎叶中提取的组合物，水溶性好，药用价值高，无明显毒副作用，保障了老年人用药的安全性。近年有研究表明，PDS 具有抗血小板聚集、降血脂、对抗磷酸二酯酶、抗心律失常、抗心肌缺血、预防感染、提高机体免疫力等作用〔13～16〕。本研究室前期研究表明PDS对内毒素休克大鼠有明显心肺保护作用〔17～19〕。本研究发现PDS有下调肾组织iNOS表达和上调Mn-SOD蛋白表达、减少NO及MDA生成的作用，从而减轻肾损伤。

综上，PDS抑制氧化应激可能是其保护LPS诱导AKI小鼠肾功能的机制，其具体的作用途径仍需进一步研究。

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