不同负荷规律运动对老年大鼠空间学习记忆能力的影响及其机制

王桂华 栾海云 马春蕾 施 真 于腊梅

(滨州医学院基础学院生理学教研室，山东 烟台 264003)

胆碱能系统在人类和实验动物记忆功能中发挥重要作用，其功能减退可导致记忆力下降。研究发现，运动可促进动物海马的神经发生水平，增加突触数量，加快长时程增强(LTP)的形成，从而提高动物的学习和记忆能力〔1〕。本实验观察运动对老年大鼠认知功能及大脑皮层和海马组织乙酰胆碱酯酶(AchE)活性的影响，探讨运动能否预防或减轻衰老引起的记忆功能减退及其可能机制。

1 材料与方法

1.1材料和仪器 Morris水迷宫(中国医学科学院研究所)、旷场实验箱(自制)，AchE试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1实验动物及分组 雄性Wistar大鼠50只，由山东大学实验动物中心提供〔SPF级，许可证号：SCXK(鲁)20090001〕。饲养于滨州医学院动物中心，温度20℃±3℃，每天12 h光照，12 h黑暗，自由饮食，将其分为青年对照组(3月龄)、老年对照组(16月龄)、老年运动组(16月龄)：15 min/d游泳组、30 min/d游泳组、力竭游泳组，每组10只。运动条件〔2，3〕为80 cm×60 cm×40 cm立方形水体，水温(25±1)℃，大鼠在水箱中游泳，四壁光滑且高出水面20 cm，无法借力及跃出。每次运动后，迅速用干毛巾擦干水分，电吹风吹干后，放回笼中休息。力竭游泳组，反复力竭运动组每天1次力竭游泳运动，大鼠尾部负重体重的3%，每天1次，每周5 d，休息2 d，连续12 w，每次运动时间不少于2 h，力竭标准，即大鼠连续沉入水中超过10 s，捞出后置于平面不能完成翻正反射。对照组动物安静饲养12 w。

1.2.2旷场实验 游泳运动12 w后，休息24 h后进行开场实验。敞箱高40 cm，长、宽为80 cm，四壁及底面为黑色，底面用白线划分为面积相等的25块。每只动物测定1次，每次测定5 min。将大鼠置于敞箱底面的中心方格内，以穿越底面的格数记录为水平运动次数，测量大鼠的活动度，以后肢直立次数记录为垂直运动次数，测量大鼠对新鲜环境的好奇程度。实验室内暗光、安静，箱底打扫清净、干燥。

1.2.3Morris水迷宫实验 旷场实验后8 h，进行水迷宫检测，水池直径为100 cm，高60 cm，水深42 cm，水温(25±1)℃，站台高度为40 cm，站台顶端平面10 cm×10 cm，平台没于水面下2 cm，水池周围参照物保持不变。训练4 d，第5天进行隐藏平台获得实验，分析处理潜伏期，考察学习能力。第6天撤去平台，进行空间搜索实验，去除平台并观察2 min内大鼠在中心区停留时间百分比和通过原平台位置次数，测试记忆能力。

1.2.4AchE活性检测 行为学实验后断头处死大鼠，冰上迅速分离全脑，分别取皮层和海马，称重后用相当于组织质量9倍的生理盐水分别将皮层和海马制成匀浆，4℃ 3 500 r/min(离心机半径为16 cm)离心10 min，去上清液，进行AChE活性检测，方法按照说明书进行。蛋白定量采用考马斯亮蓝法。

2 结 果

2.1旷场实验结果 见表1。运动前各组(除青年对照组外)大鼠水平、垂直活动数无明显差异(P>0.05)。青年对照组和老年对照组大鼠12 w后水平、垂直活动较之前均有所减少，统计学并无显著差异(P>0.05)，提示随着月龄增加，大鼠活动逐渐减少。游泳运动训练12 w后，15、30 min/d游泳运动组大鼠水平、垂直活动与老年对照组大鼠相比，明显增高(P<0.05或P<0.01)，而力竭游泳组大鼠水平、垂直活动数较老年对照组大鼠有所降低，但两者组间比较无显著性差异(P>0.05)，提示15、30 min/d游泳运动使老年大鼠活动增多，而力竭游泳运动使老年大鼠活动数和探究能力有所下降。

2.2水迷宫实验结果 隐藏平台获得实验中，与青年对照组比较，老年对照组逃避潜伏期增加(P<0.01)；15 min/d游泳和力竭游泳组潜伏期较老年对照组缩短，但无显著差异(P>0.05)，而30 min/d游泳组逃避潜伏期较老年对照组明显缩短(P<0.01)。空间搜索实验中，与青年对照组比较， 老年对照组大鼠在中心区停留时间百分比和通过原平台位置次数明显减少(P<0.01) 。与老年对照组相比，游泳运动各组中心区停留时间百分比和通过原平台位置次数均有不同程度增加，尤以30 min/d游泳组增加明显(P<0.05或P<0.01)，见表2。

2.3大脑皮层和海马AchE活性及表达 与青年对照组比较，老年对照组大鼠大脑皮层和海马AchE活性均明显升高(P<0.01)；游泳运动训练后，老年大鼠皮层和海马AchE活性均不同程度降低，以30 min/d游泳运动作用最为明显(P<0.01)。见表3。

表1 大鼠旷场实验水平运动和垂直运动得分

表2 大鼠水迷宫实验隐蔽平台搜索、空间搜索实验结果

表3 各组大鼠大脑皮层和海马组织AchE活性

3 讨 论

脑易受衰老影响，脑衰老表现为认知功能低下和中枢胆碱能系统功能下降。Singh等〔4〕发现16月龄大鼠学习记忆功能降低，故本实验选用16月龄大鼠作为研究对象，观察不同负荷运动对其干预作用。Morris水迷宫主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力。从信息的加工和提取方式来看，这种空间参考记忆储存的机制主要涉及边缘系统(如海马)以及大脑皮层相关脑区。水迷宫实验表明，老年大鼠穿越平台次数和原平台象限停留时间明显低于青年大鼠，说明老年大鼠空间学习记忆功能降低；中、小负荷运动可有效提高老大鼠的空间学习记忆能力。为排除衰老合并抑郁症， 我们引入了抑郁症动物模型的经典筛选方法开场实验排除了抑郁症所致的思维迟钝、行动迟缓、情绪低落对Morris水迷宫测试结果的影响，使行为学结果更具可靠性和科学性。

神经递质学说认为：参与或影响学习记忆功能的神经递质是多系统的，但大脑记忆功能强弱主要取决于大脑内乙酰胆碱(Ach)水平。当大脑内Ach水平高时，记忆脑区神经传导功能就会增强，脑神经之间信息传递速度加快，记忆能力增强〔5〕。胆碱酯酶可水解乙酰胆碱，生成乙酸和胆碱，终止神经冲动传递，间接反映乙酰胆碱代谢。有研究发现老年大鼠胆碱酯酶活性下降与记忆功能降低呈平行关系〔6〕，其活力直接反映该系统的功能状态，因此，Ach水平的变化可通过其水解酶AchE的活性反映。本实验结果显示老年大鼠大脑皮层和海马AchE活性增高导致Ach水平下降可造成空间学习记忆障碍。

运动对学习记忆的影响逐渐成为研究热点。研究显示，从不运动的老人通过步行运动，其思维能力如计划、安排和工作记忆力都相对有所改善〔7，8〕。大量动物实验也表明，运动有助于动物海马等与学习记忆密切相关脑区神经元的增殖、存活和分化，促进LTP的诱导，提高实验动物的空间记忆和被动逃避记忆能力〔9，10〕。运动对老年大鼠认知和记忆功能的保护作用与运动的负荷有很大的相关性，实验结果显示，老年组大鼠较青年组大鼠空间学习记忆能力功能明显下降，适当负荷运动可以提高老年大鼠的学习记忆能力，中负荷的运动效果最好；其次是小负荷运动，相对比较大负荷(力竭游泳)运动对老年大鼠的空间学习记忆能力未见明显提高，同时开场实验结果显示力竭游泳组老年大鼠表现一定程度的抑郁状态。为进一步探索运动对大鼠空间学习记忆能力的改善机制，通过检测大脑皮层和海马胆碱酯酶活力以期证明适量运动改善了脑组织Ach的水平，从而达到了改善老年大鼠对空间学习记忆的影响。结果显示，数天的不同负荷游泳运动能降低大脑皮层和海马组织胆碱酯酶活力，以小和中等负荷运动作用效果明显，大负荷运动效果并不理想， 可能大负荷运动使老年大鼠极度疲劳，处于应激状态，大量神经递质释放紊乱，影响情绪和认知功能，而起不到改善认知功能作用效果。实验结果表明，在实践中制定对老个体进行运动治疗的方案时，要针对不同的个人情况选择个性化运动方案，只有适当的运动才可以获得最好的效果。

4 参考文献

1Yau SY，Lau BW，Zhang ED,etal.Effects of voluntary running on plasma levels of neurotrophins，hippocampal cell proliferation and learning and memory in stressed rats〔J〕.Neuroscience,2012:16-8.

2Manna I，Jana K，Samanta PK.Effect of different intensities of swimming exercise on testicular oxidative stress and reproductive dysfunction in mature male albino Wistar rats〔J〕.Indian J Exp Biol，2004;42(8):816-22.

3李 华，聂晓云，王玉龙，等.不同强度运动对糖尿病大鼠认知功能的影响及机理探索〔J〕.中国神经精神疾病杂志,2008;34(8):471-8.

4Singh R，Kanwar SS，Sood PK,etal.Beneficial effects of folic acid on enhancement of memory and antioxidant status in aged rat brain〔J〕.Cell Mol Neurobiol,2011;31(1):83-91.

5Gong Y,Liu L,Xie B,etal.Ameliorative effects of lotus seedpod proanthocyanidins on cognitive deficits and oxidative damage in senescence-accelerated mice〔J〕.Behav Brain Res，2008;194(1)：100-7.

6Bartus RT.On neurodegenerative diseases，models，and treatment strategies：lessons learned and lessons forgotten a generation following the cholinergic hypothesis〔J〕.Exp Neurol,2000；163(2):495-529.

7López MD，Zamarrón MD，Fernández-Ballesteros R.Relationship between exercising and physical and cognitive function indicators.Comparison of results with age〔J〕.Rev Esp Geriatr Gerontol,2011;46(1):15-20.

8Siette J，Westbrook RF，Cotman C,etal.Age-specific effects of voluntary exercise on memory and the older brain〔J〕.Biol Psychiatry，2012；13:13-6.

9Boric K，Muoz P，Gallagher M,etal.Potential adaptive function for altered long-term potentiation mechanisms in aging hippocampus〔J〕.J Neurosci，2008；28(32):8034-9.

10Rossi EL.Gene expression，neurogenesis，and healing：psychosocial genomics of therapeutic hypnosis〔J〕.Am J Clin Hypn，2003;45(3):197-216.