1个新的玉米半透明皱缩胚乳突变体的遗传分析及基因定位

崔喜艳，胡广宇，孙小杰，佟珊珊，陈众峰，刘相国

(1 吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 130118； 2 吉林省农业科学院 农业生物技术研究所，吉林 长春 130124； 3 吉林省中玉农业有限公司，吉林 长春130012)

1个新的玉米半透明皱缩胚乳突变体的遗传分析及基因定位

崔喜艳1，2，胡广宇1，孙小杰3，佟珊珊1，陈众峰1，刘相国2

(1 吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 130118； 2 吉林省农业科学院 农业生物技术研究所，吉林 长春 130124； 3 吉林省中玉农业有限公司，吉林 长春130012)

【目的】 解析半透明皱缩玉米胚乳形成机制.【方法】以纯合玉米突变体M-E- 479为供试材料，通过对M-E- 479籽粒进行表型鉴定、遗传分析、主要成分测定及扫描电镜观察，构建定位群体，利用图位克隆技术对突变基因进行遗传定位.【结果和结论】M-E- 479突变体胚乳中脂肪含量增加，蛋白质和淀粉含量下降，淀粉粒的大小、形状、排列空间发生改变；用F2群体将突变基因定位在10号染色体SSR标记bnlg1074与umc1506之间，两标记的遗传距离约为3.6 cM，两标记的物理距离约为2.2 Mb.可见M-E- 479是一个新的玉米半透明皱缩胚乳突变体，突变性状是由隐性单基因控制.

玉米； 胚乳突变体； 遗传分析； 基因定位

玉米是重要的粮食作物，也是饲料、工业、化工、医药等的重要原料，在世界经济作物发展中也占据举足轻重的地位[1].玉米的价值主要体现在籽粒上，籽粒中胚乳部分占籽粒干质量的70%～90%[2].玉米胚乳分为角质和粉质2种类型，角质胚乳中淀粉粒小、结构致密，较硬,半透明，富含蛋白质；粉质胚乳中淀粉粒大、结构松散，较软,不透明，蛋白质含量比较少.玉米胚乳性状突变在突变体研究中较为常见，目前发现的胚乳突变体表型主要包括：皱缩、不透明、透明、凹陷、不育等多种[3- 6].随着玉米基因组学研究的不断深入，利用自然突变体或者人工突变体材料研究基因生物学功能，已成为功能基因组学研究的热点领域，越来越多的玉米胚乳突变体相继报道[7-10].

本课题组前期研究中，从自主构建的玉米自交系Mo17石蜡油-花粉-EMS诱变库中筛选得到1个胚乳突变体，编号为479.该突变体具有半透明、皱缩等性状(待发表).本研究以突变体479为试验材料，开展玉米籽粒的形态特征、遗传特性、主要成分、突变基因定位等方面研究工作，期望能够明确该突变基因的基因定位和可能的生物学功能，为进一步克隆突变基因及解析半透明皱缩玉米胚乳形成机制提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

亲本1：玉米突变体(编号479)，用甲基磺酸乙酯(EMS)的石蜡油溶液处理玉米自交系品种Mo17的成熟花粉自交后，筛选获得.该材料经过3代的遗传，鉴定为纯合突变体，命名为M-E- 479(Mo17-EMS-编号479).亲本2：玉米自交系Mo17(野生型).亲本3：玉米自交系B73(野生型).以上玉米材料均由吉林省农业科学院农业生物技术研究所提供.

1.2 构建定位群体和遗传分析

于2010年夏季吉林省公主岭市试验田，玉米自交系Mo17、B73作为母本，M-E- 479作为父本，组配F1杂交种.同年冬季海南加代，F1代果穗套袋自交，获得BC1和F2群体.BC1和F2群体用于遗传分析，F2分离群体用于基因定位.

根据表型观察结果，将BC1和F2群体中籽粒分为突变籽粒和正常籽粒2类.统计籽粒个数，利用2测验进行遗传分析.

1.3 玉米籽粒主要成分测定

粗蛋白(干基)[11]、粗脂肪(干基)[12]、粗淀粉(干基)[13]、直链淀粉(占淀粉质量)和支链淀粉(占淀粉质量)[14]按国家标准或农业部标准方法测定.

以上玉米籽粒主要成分由农业部参茸产品质量监督检验测试中心(吉林省)测定.

1.4 胚乳的扫描电镜观察

M-E- 479和对照组自交系Mo17的成熟胚乳干燥后纵切，双面胶将胚乳样品固定于检测铜台上，置于离子溅射仪中镀金膜，制备观察样本.HITACHI S-570型扫描电子显微镜进行胚乳内部结构观察.

1.5 玉米基因组DNA提取

在温室中种植F2群体突变籽粒和正常籽粒、亲本2、亲本3.三叶期剪取叶片，提取叶片基因组DNA用于基因定位分析.DNA 的提取采用CTAB法[15]，略作修改：即在用氯仿/异戊醇抽提后直接加入冷的异丙醇以沉淀DNA.

1.6 突变基因的BSA分析和定位

根据玉米数据库(http:∥www.maizegdb.org.ssr/)公布信息，设计分子标记SSR引物用于基因定位.引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.

BSA分析(Bulked segregation analysis)法也称集团分离分析法，该方法根据目标基因表型差异，构建2个相对性状的“基因池”，若在2类“基因池”中分子标记表现出多态性，说明该分子标记在遗传上与目标性状基因相连锁.

PCR总反应体系为20 μL，包括10×Buffer(Mg2+Plus)1 μL，dNTP(10 mmol·L-1) 0.4 μL，上游引物和下游引物(10 μmol·L-1)各0.25 μL，TaqDNA Polymerase(5 U·L-1)0.2 μL，ddH2O 5.9 μL，DNA模板(50 ng·μL-1)12 μL.在BioRad PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应条件:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 45 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸1 min，共进行 36个循环；72 ℃再延伸 10 min.反应产物在80 g·L-1的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，经质量分数为0.2%硝酸银染色后观测并成像分析.

2 结果与分析

2.1 M-E- 479表型分析

如图1所示，M-E- 479籽粒表面种皮皱缩，顶端质地透明(图1a)，自交系Mo17的籽粒饱满(图1b)；M-E- 479的胚乳纵切(图1c)与Mo17(图1d)相比，表现为体积变小，种皮皱缩，角质化明显，质地透明，顶端粉质部分严重缺失.

a: M-E- 479的籽粒；b: 自交系Mo17的籽粒；c: M-E- 479的胚乳(纵切)；d: 自交系Mo17的胚乳(纵切).

2.2 M-E- 479遗传分析

利用自交系Mo17、自交系B73与M-E- 479构建BC1、F2分离群体，各获得30个具有突变籽粒的果穗，统计正常籽粒与突变籽粒的数目，计算分离比(表1).2测验结果表明即正常籽粒与突变籽粒之比符合3∶1的孟德尔遗传规律分离比例，证实M-E- 479的性状是由隐性单基因控制的.

表1 BC1和F2群体性状分离结果

2.3 M-E- 479籽粒主要成分测定

从表2中可以看出，与对照组Mo17相比，突变体M-E- 479的蛋白质和淀粉含量均呈现下降趋势，分别减少5.96%和9.89%.其中，淀粉含量的减少主要体现在支链淀粉含量的剧烈下降，减少11.63%，而直链淀粉含量增加1.74%.突变体的粗脂肪含量较对照组呈现上升趋势，增加1.82%.结果表明，该突变基因与玉米胚乳中脂肪、蛋白质及淀粉等储藏物质合成代谢相关.

表2自交系Mo17和M-E- 479胚乳主要成分占干质量比例

Tab.2ThepercentageoftheendospermmainingredientsofMo17andM-E- 479 (drymass) %

品种蛋白质粗脂肪淀粉直链淀粉支链淀粉Mo1717.144.2478.9615.9962.97M-E-47911.186.0669.0717.7351.34

2.4 M-E- 479胚乳扫描电镜观察

对M-E- 479和自交系Mo17的成熟胚乳进行扫描电镜观察，结果表明：自交系Mo17角质胚乳细胞被大量淀粉粒充实，呈较规则的长多面体排列；M-E- 479角质胚乳细胞则呈圆形、椭圆形、多边形等不规则排列(图2b、2f).粉质部分300倍和2 000倍的放大图片显示：M-E- 479中胚乳细胞排列无规则，且大小不均一(图2c)，淀粉粒排列紧密，积压呈多面体状，表面附着大量基质蛋白(图2d)；Mo17中胚乳细胞规则，呈圆形，大小均一(图2g)，淀粉粒排列松散，表面较光滑，附着少量基质蛋白(图2h)；从M-E- 479和自交系Mo17胚乳结构比较来看，突变基因能够导致胚乳中淀粉粒的大小、形状、排列空间发生改变.

2.5 M-E- 479突变基因的BSA分析及定位

从玉米数据库中选择均匀覆盖玉米基因组的350对SSR标记，对亲本进行多态性的筛选，筛选到有多态性的引物112对.在F2代中分别选取10株正常籽粒和10株突变籽粒构建正常基因池和突变基因池.利用这112对SSR引物对构建好的正常基因池和突变基因池进行扩增.结果发现位于10号染色体上的SSR分子标记umc1789在2个池中表现出多态性(图3中的17、18泳道)，表明M-E- 479的突变基因位于10号染色体长臂上，在umc1789附近.

为了进一步界定突变基因的位点，在SSR标记umc1789的上游、下游设计新的引物，对513份F2代突变个体进行分析.研究结果表明：M-E- 479的突变基因定位于SSR分子标记bnlg1074与umc1506之间.在513份个体中，对于bnlg1074共筛选到6个交换单株，对于umc1506共筛选到12个交换单株，根据遗传距离的计算方法，bnlg1074与突变基因的遗传距离是1.2 cM，umc1506与突变基因的遗传距离是2.3 cM(图4)，两个SSR标记之间的物理距离约2.2 Mb.

a～d为M-E- 479, e～h为Mo17.其中,a、e:为胚乳整体图(25×);b、f:为胚乳角质图(300×); c、g:为胚乳粉质图(300×); d、h:为胚乳粉质图(2 000×).

图2 M-E-479与自交系Mo17胚乳的扫描电镜图片
Fig.2 The scanning electron microscopy of M-E- 479 endosperm and Mo17endosperm

奇数泳道为正常个体的基因池，偶数泳道为突变个体的基因池.

图4 M-E- 479突变基因的遗传图谱Fig.4 The genetic map of M-E- 479 mutant genes

3 讨论

在众多玉米突变体研究中，粉质型胚乳突变体研究最为深入.粉质型胚乳突变体即opaque突变体，主要表现不透明的且硬质淀粉部分缺失.1935年Emerson等[16]首次发现玉米o2(opaque2)突变.1964年美国普渡(Purdue)大学Mertz等[17]发现隐性突变基因o2能够抑制胚乳玉米醇溶蛋白合成，提高胚乳中赖氨酸含量.1971年McWhirter[18]发现一个玉米高赖氨酸粉质胚乳突变体，命名为o7(opaque7)突变体，该突变基因位于玉米第10号染色体.2005年Yang等[19]从Robertson增变子Mu(Mutator)突变群体中，分离得到一个胚乳质地不透明、高赖氨酸突变自交系，命名为o16(opaque16)，定位于第8号染色体长臂上umc1141和umc1121 这2个分子标记之间，遗传距离约为5 cM.除了粉质型胚乳突变体之外，透明/半透明玉米胚乳突变体的研究也备受关注.该类型突变体主要表现为粉质淀粉部分缺失.目前，关于该类突变体的研究主要有su1(sugary1)突变体和ae1(amyloseextender1)突变体2种.1911年East等[20]首先描述su1突变体，突变基因在乳熟期能阻止糖分向淀粉转化，使还原糖、蔗糖含量显著高于普通玉米，使玉米未成熟籽粒中大量累积水溶性多糖，成熟时籽粒皱缩且透明.1952年Vineyard等[21]首次记述ae1突变体，它是由编码淀粉分支酶SBEIIb的基因突变形成的.该突变基因降低了支链淀粉的α-1,6糖苷键分支点的数量而相应地增加了籽粒表观直链淀粉含量.大量玉米突变体的发现及突变基因的分离可为特异玉米品种的创制提供种质资源及候选基因.

随着玉米自交系Mo17和B73全基因组序列测序的完成[22]，以及玉米高密度遗传图谱和物理图谱相继构建成功[23]，图位克隆技术在玉米功能基因研究领域中开始广泛应用.2011年Wang等[24]和孙大元等[25]利用图位克隆技术对突变基因o7进行了深入分析，克隆该基因全序列，分析表明，其编码一个草酰辅酶a合成酶，参与储藏蛋白质的合成代谢.

本研究利用图位克隆技术将M-E- 479的突变基因定位于10号染色体上Bin10.04处，根据玉米数据库公布信息发现，在10号染色体上有2个关于胚乳突变的突变体:o7(opaque7)和du1(dull1)[22]，但o7和du1突变基因位点分别在10号染色体上Bin10.03和Bin10.07处，与M-E- 479的突变基因位点不同；o7和du1籽粒表现型为不透明且饱满，M-E- 479籽粒表现型为半透明且皱缩，从表型上来看,M-E- 479不是o7或du1的这类胚乳突变体.此外，M-E- 479的突变基因定位在SSR分子标记bnlg1074与umc1506之间，查阅文献可知两标记之间已经公布了4个玉米基因wsm3、AY110167、IDP2392和TIDP2822，其中基因wsm3导致玉米叶片出现黄绿斑,其余3个基因只是被克隆了全序列，鲜见基因功能验证的报道[24- 28].本研究中基因定位区段还未发现与玉米胚乳发育和形成相关基因克隆的报道.综上所述，本研究鉴定M-E- 479是一个新的玉米半透明皱缩胚乳突变体.

扫描电镜观察结果发现，该基因突变导致胚乳中淀粉粒的形态和空间排列发生显著改变，M-E- 479突变基因可能是通过影响胚乳中淀粉粒的形成来调控玉米淀粉合成代谢.从玉米籽粒物质含量测定数据可以看出，突变体胚乳中蛋白质和淀粉含量显著下降，脂肪含量却明显增加.由此推测该突变基因不仅参与淀粉合成代谢，还可能参与调控玉米胚乳中脂肪、蛋白质及淀粉等储藏物质间的协同转换.

本研究将玉米胚乳突变基因定位在10号染色体上SSR分子标记bnlg1074与umc1506之间，在两标记之间尚无公布的对于定位群体具有多态性的SSR引物.虽然我们已经开发与该突变基因紧密连锁的新的SSR分子标记，但由于筛选到的交换单株较少，目前还无法进行M-E- 479突变基因的精细定位.未来的研究中，我们会加大定位群体数量，筛选更多的交换单株，完成突变基因定位、克隆和功能解析等研究工作.这些研究的顺利进行对于未来解析半透明皱缩玉米胚乳形成机制具有重要意义.

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【责任编辑李晓卉】

Ageneticanalysisandgenemappingofanewtranslucentandshrunkenendospermmutantinmaize

CUI Xiyan1,2, HU Guangyu1, SUN Xiaojie3, TONG Shanshan1,CHEN Zhongfeng1, LIU Xiangguo2

(1 College of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118，China; 2 Institute of Agricultural Biotechnology in Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130124, China; 3 Jilin Sino-Corn Agricultural Co., Ltd., Changchun 130012, China)

【Objective】 To analyze the formation mechanism of translucent and shrunken maize endosperm. 【Method】 The mutant M-E- 479 of homozygous maize was used as experimental materials in our study. Through phenotypic identification, genetic analysis, main ingredients measurement and scanning electron microscopy, mapping population of M-E- 479 was selected and map-based cloning technology was performed to locate the mutant gene.【Result and conclusion】 The result showed that the amount of fat increased, while the protein and starch decreased, and the starch grains changed in size, shape and space configuration in the mutant endosperm of M-E- 479. The mutant gene is located between SSR markers bnlg1074 and umc1506 of chromosome 10 by using F2 population. Meanwhile, the genetic distance is about 3.6 cM and the physical distance is about 2.2 Mb. The results suggest that M-E- 479 is a new translucent and shrunken maize endosperm mutant, and its mutant character may be controlled by a recessive single gene.

maize; endosperm mutant; genetic analysis; gene mapping

2013- 09- 21优先出版时间2014- 07- 17

优先出版网址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140717.0909.027.html

崔喜艳(1971—)，女，副教授，博士，E-mail: cuixiyan2005@163.com; 通信作者:刘相国(1983—)男，助理研究员，博士，E-mail:lxgyyj@foxmail.com

国家自然科学基金(31170731，31200611)；上海市科学技术委员会资助项目(10DZ2271800)；吉林省科技发展计划项目(20130206012NY)

崔喜艳，胡广宇，孙小杰，等.1个新的玉米半透明皱缩胚乳突变体的遗传分析及基因定位[J].华南农业大学学报，2014,35(5):31- 35.

S513.035.2

A

1001- 411X(2014)05- 0031- 05