厄贝沙坦对糖尿病大鼠心肌转化生长因子-β1和结缔组织生长因子表达的影响

刘 洋 胡翠宁

(锦州市中心医院内分泌科，辽宁 锦州 121001)

心肌纤维化是糖尿病心肌病(DCM)的一个重要特征，是导致心肌收缩和舒张功能障碍的重要因素〔1〕。研究表明，转化生长因子-β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)参与了DCM心肌纤维化的发生发展过程〔1〕。厄贝沙坦作为血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体拮抗剂可阻断肾素-血管紧张素系统(RAS系统)，在DCM中发挥重要的心肌保护作用。本实验通过建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型，并用厄贝沙坦进行干预，探讨厄贝沙坦对DCM大鼠TGF-β1、CTGF的影响及其抑制心肌纤维化,改善心功能的机制。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)；厄贝沙坦(商品名安博维，杭州赛诺菲安万特制药有限公司)；兔抗大鼠TGF-β1、CTGF多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；BL-420F生物机能实验系统(上海康为医疗科技发展有限公司)；One Touche 血糖仪(美国强生公司)；CIAS-1000细胞图像分析仪(北京大恒图像视觉有限公司)；JEM-1200EX透射电子显微镜(日本)。

1.2动物分组、模型制备及给药方法 健康雄性SD大鼠30只，体重(BW)200～250 g，由辽宁医学院实验动物中心提供。适应性喂养1 w后，随机抽取30只给予高糖高脂饲料(饲料组成：10.0%猪油、20.0%蔗糖、2.5%胆固醇、1.0%胆酸盐、66.5%常规饲料)喂养，4 w后禁食12 h，给予1% STZ 30 mg/kg尾静脉一次性注射，临用前用0.1 mmol/L pH值为4.5的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制，72 h后尾静脉采血测血糖≥16.7 mmol/L为造模成功〔2〕。其余10只作为正常对照组，给予常规饲料喂养，4 w后注射等体积枸橼酸钠缓冲液。将20只造模成功大鼠随机分为糖尿病模型组、厄贝沙坦组，每组10只。厄贝沙坦组灌胃给予厄贝沙坦50 mg·kg-1·d-1，正常对照组、糖尿病组每日灌胃给予等体积的生理盐水，连续用药12 w结束实验。每周用血糖仪测一次尾静脉血血糖，血糖<16.7 mmol/L者及时剔除实验。

1.3血流动力学指标检测 12 w末，各组大鼠断尾采血测血糖后称体重(BW)，用20%的乌拉坦(4 ml/kg)腹腔注射麻醉，于颈部偏右侧开纵形切口，分离右侧颈总动脉，经右颈总动脉插管至左心室，连接BL-420F生物机能实验系统，测定左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室压力上升及下降最大速率(±dp/dtmax)。

1.4心脏重量指数(HWI)和左心室重量指数(LVWI)测定 将大鼠迅速开胸取出心脏，冰生理盐水洗净，滤纸吸干后称心脏重量(HW)，剖取心脏，将左右心房和右心室剪去，剩余部分即为左心室，称左心室重量(LVW)。计算HWI(HW/BW)和LVWI(LVW/BW)。从左心室取部分心尖部组织，置于10%中性甲醛中固定，用于光镜观察心肌组织形态学改变和免疫组化法检测TGF-β1、CTGF的表达；剩余心尖部组织置于2.5%戊二醛中固定，用于电镜观察心肌组织超微结构变化。

1.5HE染色光镜观察心肌组织形态学改变 取置于10%中性甲醛中固定的部分心尖部组织，脱水透明浸蜡，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察心肌组织形态学改变。

1.6免疫组化法检测TGF-β1、CTGF蛋白表达 采用SABC法，一抗为兔抗大鼠TGF-β1、CTGF多克隆抗体，按试剂盒说明书进行操作，显微镜下观察细胞质出现棕黄色颗粒为阳性表达，每张切片选取5个视野，应用CIAS-1000细胞图像分析系统进行图像分析，测定平均光密度值(OD值)，取其均值。

1.7电镜观察心肌组织超微结构变化 每组随机选取2只大鼠心尖部组织，切成1 mm3大小组织块，置于2.5%的戊二醛溶液中固定2 h，1%锇酸固定1 h后，乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片(50 nm)后醋酸铀-柠檬酸铅染色，JEM-1200EX透射电镜观察各组大鼠心肌组织超微结构变化。

1.8统计学分析 应用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1一般状况比较 正常对照组：体重明显增加，精神状况良好，皮毛有光泽，反应灵敏。糖尿病组：精神萎靡，明显消瘦，出现多饮、多尿，弓背蛇体，皮毛无光泽，活动减少，反应迟钝。厄贝沙坦组：精神状况较好，反应灵敏度较正常对照组稍差，但仍高于糖尿病组。实验过程中糖尿病组大鼠死亡2只，厄贝沙坦组死亡1只，死亡原因是血糖过高导致糖尿病酮症酸中毒、感染。

2.2大鼠血流动力学结果比较 与正常对照组比较，糖尿病组大鼠LVEDP明显升高(P<0.01)，LVSP和±dp/dtmax明显降低(P<0.01)；与糖尿病组比较，厄贝沙坦组LVEDP明显降低(P<0.01)，LVSP和±dp/dtmax升高(P<0.05和P<0.01)，见表1。

2.3大鼠血糖、BW、HWI、LVWI比较 与正常对照组比较，糖尿病组和厄贝沙坦组血糖明显升高(P<0.01)，糖尿病组和厄贝沙坦组血糖比较无明显差别(P>0.05)；糖尿病组大鼠HWI、LVWI高于正常对照组(P<0.01)；厄贝沙坦组HWI、LVWI低于糖尿病组(P<0.05和P<0.01)，见表2。

表1 各组大鼠血流动力学结果比较

表2 各组大鼠血糖、BW、HWI、LVWI比较

2.4HE染色光镜下观察心肌组织形态学变化 正常对照组大鼠心肌细胞排列整齐致密，细胞核呈圆形或椭圆形，大小均匀，细胞间质正常，肌纤维排列整齐，无断裂；糖尿病组心肌细胞肥大、肿胀、坏死，边界不清，间质及间质胶原较多，肌纤维部分断裂，排列明显紊乱；厄贝沙坦组心肌细胞变性坏死程度和间质纤维化程度范围明显减轻，见图1。

图1 大鼠心肌组织HE染色结果(×200)

2.5电镜下观察心肌组织超微结构变化 正常对照组大鼠心肌细胞核呈椭圆形，染色质均匀分布，肌丝结构清楚，Z带和I带整齐规则，未见肌丝溶解，线粒体结构正常清晰，细胞间质较少。糖尿病组心肌细胞核轻度肿胀，染色质分散分布，线粒体结构模糊，细胞器结构紊乱，肌丝结构不清，肌纤维间隙增宽，肌丝溶解，Z带和I带部分走行紊乱，间质胶原纤维增多，心肌纤维化明显。厄贝沙坦组心肌病变明显减轻，部分肌原纤维排列紊乱，线粒体水肿减轻，细胞间质减少。

2.6心肌组织TGF-β1、CTGF的蛋白表达结果比较 见表3，图2,图3。与正常对照组比较，糖尿病组心肌组织TGF-β1、CTGF的表达明显升高(P<0.01)；与糖尿病组比较，厄贝沙坦组心肌组织TGF-β1、CTGF的表达明显降低(P<0.01)。

表3 各组大鼠心肌组织TGF-β1、CTGF的平均OD值比较

图2 大鼠心肌组织TGF-β1表达(×400)

图3 大鼠心肌组织CTGF表达(×400)

3 讨 论

DCM以心肌细胞肥大、凋亡、心肌间质胶原沉积和纤维化为主要特征，是糖尿病患者晚期的主要死亡原因之一。STZ诱导糖尿病大鼠于成模后8 w左右就可以出现DCM的表现。本实验采用高脂高热量饮食诱导出胰岛素抵抗，加尾静脉注射小剂量STZ建立DCM动物模型成功。经厄贝沙坦干预后，心肌病变明显减轻，与多数研究结果相一致〔3〕。

本实验表明TGF-β1、CTGF与DCM的发生发展过程有密切关系，这一结论与郎宏涛等〔4〕的研究相似。TGF-β1是最重要的致心肌间质纤维化细胞因子之一。TGF-β1是多功能生长因子，一方面对许多组织器官的生长分化起着重要作用，另一方面通过发挥促进心肌细胞肥大，促进细胞外基质(ECM)如FN、Ⅱ型胶原等的合成和抑制ECM降解，使ECM在细胞周围沉积，胶原增生等作用造成糖尿病的靶器官损伤，参与了DCM的发病过程，导致心功能不全，最终导致心力衰竭的发生。研究发现，糖尿病时高血糖〔5〕、AngⅡ〔6〕、糖尿病时晚期糖化终末产物(AGEs)〔7，8〕、一氧化氮〔9〕等多种因素均可引起心肌组织中TGF-β1升高，因此，抑制心肌组织中TGF-β1的高表达成为DCM治疗的靶标。

Piet等〔10〕研究发现，在拥有人类肾素及血管紧张素原基因的转基因鼠中，CTGF表达水平增高的同时伴有TGF-β1、Ⅰ型胶原基因和Ⅲ型胶原基因表达增高。大量文献表明TGF-β1是CTGF的强诱导剂，在CTGF的启动子-157至-145核苷酸序列存在一个新的应答元件，CTGF是TGF-β1发挥纤维化作用的下游效应介质。因此，TGF-β1的生物学作用部分由CTGF介导的。体外实验发现TGF-β1可引起人心脏心肌细胞及成纤维细胞中CTGF mRNA表达增高，并伴随细胞外基质的产生增加，CTGF的拮抗剂可抑制TGF-β1诱导的致纤维化作用。

DCM病后肾素-血管紧张素醛固酮系统(RAS)系统处于激活状态，心肌局部AngⅡ可直接通过蛋白激酶C(PKC)途径引起TGF-β1过度表达，并通过细胞表面的AT1受体介导CTGF表达增加，两者均可促进心肌间质纤维化以及细胞外基质胶原沉积，导致心肌肥厚及纤维化，最终导致心室收缩及舒张功能受损〔11〕。厄贝沙坦为AT1受体拮抗剂，可阻止AngⅡ与AT1受体结合，阻断内源性及外源性AngⅡ引起的心肌纤维化。在STZ诱导糖尿病大鼠模型中，心肌组织CTGF表达和AngⅡ含量呈明显的正相关，厄贝沙坦干预后，CTGF表达和AngⅡ含量均降低〔12〕。研究表明，短期或长期应用AngⅡ可导致STZ大鼠心肌细胞凋亡，AT1受体拮抗剂氯沙坦则可减轻DCM大鼠心肌纤维化并改善心功能〔13，14〕。本实验表明厄贝沙坦通过选择性地与AT1受体结合降低了TGF-β1的表达，从而间接影响了CTGF的表达，并且在抑制心肌纤维化的同时，改善了糖尿病大鼠的心功能。

本实验表明厄贝沙坦通过降低DCM心肌组织TGF-β1和CTGF的表达，发挥抑制心肌间质纤维化，改善心功能的作用，从而为DCM进展为心力衰竭提供了新的治疗靶点，为厄贝沙坦治疗DCM提供了有力的实验依据。

4 参考文献

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4郎宏涛，刘素筠.氯沙坦钾和辛伐他汀对1型糖尿病大鼠心肌中CTGF和TGF-β1的影响〔J〕.中国医疗前沿,2011；6(3):19-21.

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