p73基因不同异构体模式对U2OS细胞顺铂敏感性的影响

刘 军 肖 军 张山锋 毛 唯 杨钟华

(武汉市普爱医院骨外科，湖北 武汉 430030)

多发性骨髓瘤是终末分化的浆细胞异常克隆性增生的恶性血液系统肿瘤，是一种低凋亡活性的分子克隆性疾病，伴随着对癌基因激活和抑癌基因失活的深入, 基因治疗被引入肿瘤治疗的方法中。流行病学研究发现，p73基因在健康人骨髓中低表达，而在骨髓瘤患者中高表达，在轻链型骨髓瘤表达明显高于在其他亚型骨髓瘤中的表达，而且p73基因的表达与骨髓瘤的分期呈正相关〔1〕。本研究通过siRNA干扰技术抑制骨髓瘤细胞系U2OS中p53基因的表达，在削弱p53表达的遗传背景下，观察TAp73和DNp73对顺铂诱导的U2OS细胞株增殖抑制和细胞凋亡的影响，并初步探讨相关作用机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂和细胞株 人骨髓瘤细胞株U2OS购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。胎牛血清、MEM培养基均为美国Gibco公司产品。顺铂(P4394)购自美国Sigma公司。p53基因siRNA序列由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成。RIPA蛋白裂解液(强型)和ECL化学发光液均购自江苏碧云天生物技术研究所。β-actin、TAp73、DNp73、Bax和Bcl-2抗体购自美国Bioworld Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司。脂质体转染试剂Lipo2000购自美国Invitrogen公司。四甲基氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma-Aldrich公司。羊抗鼠和羊抗兔二抗均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 U2OS细胞培养于含10%胎牛血清的MEM培养基，经0.25%胰蛋白酶消化传代后置含5%CO2的37℃培养箱内培养，每2天传代1次。

1.2.2p53 siRNA转染U2OS细胞 由上海吉玛制药设计并合成特异性针对p53基因mRNA的siRNA序列和阴性对照siRNA序列。p53 siRNA正义链：5′-CCCGGACGAUAUUGAACAATT-3′；反义链：5′-UUGUUCAAUAUCGUCCGGGTT-3′。阴性对照siRNA正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACG-3′； 反义链：5′- ACGUGACACGUUCGGAGA-3′。选处于对数生长期的U2OS细胞制备单细胞悬液(2.0×105/ml) 接种在12孔培养板中，每孔1 ml细胞悬液，待细胞贴壁后，参照Lipo2000转染说明进行RNA转染操作，设3个实验组：空白对照组(未经RNA干扰处理的U2OS细胞)；p53 siRNA干扰组(转染p21 siRNA的U2OS细胞)；阴性对照组(转染阴性对照siRNA的U2OS细胞)，转染6 h更换新鲜培养液，继续孵育18 h后收集细胞。Western 印迹方法验证转染效率(方法见1.2.5)。

1.2.3MTT试验 选处于对数生长期的U2OS细胞制备单细胞悬液，以每孔5.0×103个细胞接种于96孔培养板24 h后。分别加入终浓度为0(溶剂对照)、5、10、20和40 μmol/L的顺铂处理细胞24 h。移去含有顺铂的细胞培养液，PBS液缓冲液清洗2次，每孔加入100 μl MTT 溶液(终浓度为0.05 mg/ml)，37℃孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μl 二甲基亚砜(DMSO)溶液，在摇床轻轻振荡10 min溶解结晶后，采用Synergy 2 型多功能酶标仪在570 nm处测定光密度(OD)值，并计算细胞生长率(细胞生长率=OD顺铂组/OD对照组×100%)。

1.2.4Annexin V-FITC/PI双染法分析细胞凋亡情况 将处于对数生长期的U2OS细胞调整成细胞浓度为2.5×104/ml 后，接种于6孔板中培养24 h，按前述方法顺铂处理24 h后，PBS洗涤2次，0.25%胰酶消化，1 000 r/min离心10 min收获细胞，并制备成浓度为5.0×106/ml单细胞悬液，取100 μl细胞悬液，加入400 μl 上样缓冲液重悬细胞，分别加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI混匀，常温避光孵育20 min，流式细胞仪检测细胞凋亡变化情况。

1.2.5Western 印迹法测定TAp73、DNp73、Bax和Bcl-2蛋白表达水平 将处于对数生长期的U2OS细胞调整成细胞浓度为2.5×104/ml 后，接种于6孔板中培养24 h，按前述方法顺铂处理24 h。移去含顺铂的细胞培养液，用4℃预冷PBS洗涤2次，0.25%胰酶消化，1 000 r/min离心10 min收获细胞于1.5 ml的Ep管中，每管加入25 μl细胞裂解液冰上裂解30 min，以14 000 r/min离心15 min，取上清液，采用BCA 法进行蛋白质定量。取等量的待测蛋白样品与5×SDS蛋白质上样缓冲液混匀，95℃变性5 min。在10%SDS-聚丙烯酰胺中凝胶电泳2 h，转印至PVDF 膜(孔径为0.45 μm)。用含5%脱脂奶粉的封闭缓冲液(tris-buffered saline Tween-20，TBST)37℃孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。加一抗4℃过夜(稀释倍数为1∶400)。次日，TBST洗膜3次，每次5 min。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(稀释倍数均为1∶2 500)在37 ℃孵育1 h。TBST洗膜3次。加入ECL化学发光液，采用荧光化学发光凝胶成像分析系统检测蛋白表达，并通过系统自带软件分析各组蛋白条带的灰度值进行比较。

1.3统计学方法 采用SPSS11.5软件进行t检验。

2 结 果

2.1p53siRNA对U2OS细胞中p53蛋白表达的影响 p53 siRNA干扰组p53蛋白表达水平显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)；而阴性对照组与空白对照组p53蛋白表达水平比较则差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

1.空白对照组；2.阴性对照组；3.siRNA干扰组

2.2细胞活力检测结果 随着处理浓度的增加，5、10、20、40 μmol/L U2OS细胞活力随之降低(0.897±0.057、0.825±0.073 9、0.784±0.047 8、0.713±0.062 1)，呈剂量-效应关系，且与空白对照组差异(P<0.01)。

2.3细胞凋亡分析结果 随着处理浓度的增加，5、10、20、40 μmol/L U2OS细胞凋亡率随之增加(7.833±2.071、16.795±4.388、10.054±2.977、27.882±5.217)呈剂量-效应关系，且与空白对照相比差异均有统计学意义(P<0.01)。

2.4Western 印迹法结果 随着处理浓度的增加，U2OS细胞中TAp73、DNp73和Bax蛋白表达量明显增加，与空白对照组均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见图2。而各浓度顺铂处理组的Bcl-2蛋白表达量与空白对照组相比无明显变化(P>0.05)。随着顺铂处理浓度的增加，TAp73/DNp73和Bax/Bcl-2也明显升高，与溶剂对照组相比均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表1。随着不同浓度顺铂处理U2OS细胞24 h，细胞内TAp73与DNp73蛋白相对表达水平比值TAp73/DNp73大体上呈剂量依赖性升高；当浓度>5 μmol/L时有统计学意义(P<0.05)，当浓度>10 μmol/L时具有显著统计学意义(P<0.01)。随着不同浓度顺铂处理U2OS细胞24 h，细胞内Bax/Bcl-2蛋白相对表达水平呈剂量依赖性性升高；当浓度>5 μmol/L时有统计学意义(P<0.05)，当浓度>10 μmol/L时具有显著统计学意义(P<0.01)。

表1 各浓度U2OS组各蛋白表达

图2 不同浓度顺铂处理U2OS细胞24 h时TAp73、DNp73、Bax和Bcl-2蛋白水平变化

3 讨 论

p73基因与经典的抑瘤基因p53高度同源，由于其存在两类功能相反的异构体，使调控功能远比p53复杂。TAp73异构体中的p73α或p73β过度表达时可激活p53靶基因的转录，引起细胞凋亡〔2,3〕。Zhu等〔4〕研究显示，p73α能增强由化疗药物诱导的MCF-7细胞株的凋亡，能与顺铂等DNA损伤剂共同诱导p53靶基因的表达，能以依赖p53基因的途径联合DNA损伤剂增强细胞的凋亡效应〔5〕。何勇等〔5〕等利用转染技术将野生型p73α基因导入p53基因纯合缺失的人肺腺癌细胞株H1299，发现p73α的表达上调，可以使肺腺癌细胞对DNA损伤剂化疗药物的敏感性显著升高。这表明化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡包括p53依赖和非p53依赖两条途径。与TAp73相反，DNp73转录激活区缺失，无法激活p53和TAp73靶基因的转录，但却发现其在多数肿瘤组织中呈现出高表达，如乳腺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、胃癌、胰腺癌和肺癌等〔6,7〕；另外，有研究发现，裸鼠一旦接种转染了DNp73的NIH3T3细胞，将很快形成肿瘤〔8〕。Pozniak等〔9〕研究证实，在全长TAp73异构体占优势的细胞中，p73可协同p53来诱导细胞凋亡；而在DNp73异构体占优势的细胞中，p73则削弱p53诱导的细胞凋亡效应。因此，在肿瘤发生发展以及肿瘤耐药的过程中，p73不同异构体表达模式(TAp73/DNp73表达比)的变化比单纯某一亚型表达水平的改变更有意义。

MTT和细胞凋亡结果提示在本实验体系中，顺铂处理激活了p53非依赖性细胞凋亡信号通路。进一步研究发现，在各顺铂处理组中，TAp73和DNp73的表达量均明显上调，但前者上升趋势更强，使得TAp73/DNp73的比值随着顺铂浓度的增加而显著升高；同时，p53(或TAp73)依赖性的线粒体促凋亡蛋白Bax的表达量明显升高，而其拮抗蛋白Bcl-2的表达变化不显著，因此，Bax/Bcl-2的比值随着顺铂处理浓度的增加而显著升高，使得细胞向有利于凋亡的方向发展。本实验模型说明，顺铂处理首先激活了TAp73的表达，激活的TAp73分别上调了DNp73和Bax的表达，进而使得TAp73/DNp73和Bax/Bcl-2两个比值升高，细胞走向凋亡。

综上所述，TAp73/DNp73比值的变化可显著提高U2OS-p53对于化疗药物顺铂的敏感性。由此，在骨髓瘤的临床诊疗过程中，针对化疗药物耐药的肿瘤病例，p73基因不同异构体表达模式将有可能作为一个重要的基因治疗靶点，增强肿瘤的药物敏感性。

4 参考文献

1徐聪琴，郑翠萍，谢军军，等. P73基因在骨髓瘤的表达及临床意义〔J〕. 中国卫生检验杂志，2011；21(10):2458-60.

2Jost CA,Marin MC，Kaelin WG.p73 is a simian[correction of human]p53-related protein that can induce apoptosis 〔J〕. Nature,1997;389 (6647):191-4.

3Ramadan S,Terrinoni A,Catani MV,etal.Candi p73 induces apoptosis by different mechanisms 〔J〕. Biochem Biophys Res Commun,2005;331 (3): 713-7.

4Zhu J, Nozell S, Wang J,etal.p73 cooperates with DNA damage agents to induce apoptosis in MCF7 cells in a p53-dependent manner 〔J〕. Oncogene,2001;20 (30): 4050-7.

5何 勇，范士志，蒋耀光，等.p73基因对人肺腺癌细胞H1299化疗敏感性的影响〔J〕. 癌症,2004;23(6):645-9.

6Bantel H,Simon HU.DeltaNp73beta is oncogenic in hepatocellular carcinoma by blocking apoptosis signaling via death receptors and mitochondria 〔J〕. Cell Cycle,2010;9(14):2710-1.

7Uramoto H,Sugio K,Oyama T,etal.Expression of deltaNp73 predicts poor prognosis in lung cancer 〔J〕. Clin Cancer Res,2004;10(20):6905-11.

8Stiewe T,Zimmermann S,Frilling A,etal.Transactivation-deficient DeltaTA-p73 acts as an oncogene 〔J〕. Cancer Res, 2002; 62 (13): 3598-602.

9Pozniak CD,Radinovic S,Yang A,etal.An anti-apoptotic role for the p53 family member, p73, during developmental neuron death 〔J〕. Science,2000;289(5477):304-6.