姜黄素联合奥沙利铂对人胃癌BGC-823细胞的作用

韩金荣 罗 强 刘 华 孙 黎 张林西

(河北北方学院生命科学研究中心，河北 张家口 075000)

姜黄素的多种药理活性与其抗氧化、抗炎作用有关〔1〕。目前已有实验证实姜黄素对多种肿瘤细胞具有抑制生长和诱导凋亡的作用，其抗肿瘤机制各不相同〔2〕。奥沙利铂(L-OHP)为第三代铂类化合物，是消化系统肿瘤化疗方案中的常用药物。本研究旨在探讨姜黄素联合L-OHP对L-OHP杀伤胃癌细胞的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1材料 姜黄素购于天津市科密欧化学试剂有限公司；奥沙利铂由江苏恒瑞医药股份有限公司出品；Caspase-3活性检测试剂盒、CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒、FITC标记山羊抗兔二抗购自碧云天生物技术研究所；兔抗人FAS一抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司；人胃癌BGC-823细胞为河北北方学院生命科学研究中心保存。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将BGC-823细胞接种于培养瓶中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2条件下培养。取对数生长期细胞用于本实验。

1.2.2细胞生长抑制试验(CCK-8法) 取5×104/ml 的细胞悬液接种于96孔板中，按阴性对照组、姜黄素组、奥沙利铂组、联合作用组，分别来加药物。每个组的浓度设4个复孔。培养箱中再孵育24 h后，每孔加入20 μl CCK-8 溶液，继续孵育4 h，酶标仪检测各孔在490 nm处的光吸收值(A490值)，按照公式计算抑制率。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡率 收集对数生长期细胞，离心计数，调整细胞浓度为5×105/ml，每孔2 ml接种于6孔板中，培养24 h后加入药物。阴性对照组加入完全培养基2 000 μl，姜黄素组终浓度20 μmol/L，奥沙利铂组终浓度为10 μmol/L，联合作用组姜黄素和奥沙利铂的浓度分别为20、10 μmol/L，设3个复孔。继续培养24 h后，用0.25%胰酶消化后离心收集细胞，用磷酸盐缓冲(PBS)液轻轻重悬细胞并计数。取1×106个重悬细胞，离心弃上清后加入195 μl Annexin V-FITC结合液，5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育10 min，离心弃上清，加入190 μl Annexin V-FITC结合液、10 μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀随即进行流式细胞仪检测。

1.2.4流式细胞仪检测Fas在细胞中的表达 收集对数生长期细胞，离心计数，取5×105/ml的细胞悬液按每孔2 ml接种于6孔板中，培养24 h后，加药和分组同流式细胞术检测细胞凋亡率。设3个复孔，继续培养24 h后收集细胞，PBS液洗涤2次，加入1∶100稀释的一抗100 μl，在37℃恒温水浴中温育30 min，PBS液洗涤2次，然后加入1∶20稀释的FITC标记的二抗100 μl，37℃水浴30 min，PBS洗涤2次，除去未结合的荧光抗体。加入1 ml PBS，将样品上机进行测定Fas蛋白。

1.2.5分光度法检测Caspase-3 酶活性 收集对数生长期细胞，制成1×107/ml的细胞悬液，每孔2 ml接种于6孔板中，培养24 h后加入药物。进一步操作同上，再次培养24 h后，胰酶消化收集细胞。冰浴裂解后，按Caspase-3活性检测试剂盒说明书测定pNA标准曲线和检测Caspase-3酶活性，重复3次。

2 结 果

2.1细胞生长抑制试验 2.5,5.0,10,20,40 μmol/L 5个不同浓度的姜黄素作用BGC-823细胞24h，对BGC-823细胞增殖均能明显的抑制，抑制率分别为(7.38±0.14)%，(11.02±0.17)%，(18.89±0.15)%，(34.92±0.18)%，(39.84±0.29)%。1.25,2.5,5,10,20 μmol/L 5个不同浓度的奥沙利铂作用BGC-823细胞24 h，对BGC-823细胞的抑制率分别为(6.41±0.12)%，(12.61±0.15)%，(22.74±0.25)%，(27.84±0.28)%，(42.03±0.31)%。姜黄素和奥沙利铂二者联合作用于BGC-823细胞24 h，对BGC-823细胞的抑制率分别为(14.05±0.21)%，(22.79±0.23)%，(40.15±0.32)%，(57.80±0.27)%，(70.79±0.39)%。上述结果显示，姜黄素和奥沙利铂单用及联合作用时均能够抑制BGC-823细胞的增殖，且呈现出明显的剂量依赖性。联合作用组的抑制率显著高于单独用药组(均P<0.01)。

2.2流式细胞术检测细胞凋亡率 姜黄素组、奥沙利铂组、联合作用组细胞凋亡率分别为(25.87±4.41)%、(26.93±4.40)%、(62.63±1.90)%与阴性对照组(2.17±0.25)%相比，差异有统计学意义(均P<0.01)。

2.3姜黄素和奥沙利铂对细胞凋亡相关基因Fas蛋白表达的影响 姜黄素和奥沙利铂均能增加Fas基因的表达，且联合作用组明显高于单药组，与对照组表达率比较差异显著(P<0.01)。见表1。

2.4Caspase-3活性变化 姜黄素组、奥沙利铂组中Caspase-3活性的相对值，与阴性对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。联合作用组Caspase-3活性的相对值，明显高于阴性对照组、姜黄素组、奥沙利铂组(P均<0.01)。见表1。

表1 姜黄素和奥沙利铂作用24 h后胃癌BGC823细胞中Fas表达和Caspase-3活性的变化

3 讨 论

姜黄素是从姜科植物姜黄地下根茎中分离出来的具有广泛生物活性的物质，由于其明显的抗肿瘤特性，美国国立肿瘤研究所将其定为第三代癌化疗预防药〔3〕。奥沙利铂作为第三代铂类抗肿瘤药物，临床应用广泛。

胃癌是常见的消化道肿瘤，其发生、发展不仅与肿瘤细胞异常分化、过度增殖有关，而且与细胞凋亡减少有关，故诱导肿瘤细胞凋亡将成为肿瘤治疗的新途径〔4〕。

细胞凋亡的发生，通过一种内源性途径(也称为线粒体途径)和外源性途径(又称死亡受体途径)〔5〕。最重要的配体死亡受体系统包括肿瘤坏死因子(TNF)，肿瘤坏死因子受体-1，Fas-L的Fas(也称为CD95或Apo1)和TRAIL的TRAIL受体〔6〕。Fas和Fas-L的结合导致Fas相关死亡域(FADD)的寡聚受体与FADD形成死亡诱导信号复合物，这引发半胱氨酸蛋白酶结合，从而Caspase的级联活化，Caspase-3的活化，从而导致细胞凋亡〔7〕。Fas/Fas-L在胃癌和结肠肿瘤中均有表达〔8〕。因此，Fas/Fas-L系统是细胞凋亡的一个重要环节。

本实验发现在BGC-823细胞中姜黄素和奥沙利铂激活了Fas的表达，Fas表达增加能够促进肿瘤细胞发生凋亡。季宇彬等〔9〕在莱菔硫烷诱导人肝癌于HepG2细胞凋亡中报道与此一致。同时本研究发现，姜黄素和奥沙利铂诱导BGC823细胞凋亡的过程中Caspase-3的活性也升高，这与曾呈军等〔10〕在胃癌和杨春梅等〔11〕在结肠癌中的报道相类似。张静等〔12〕也发现姜黄素可能通过激活Caspase-3诱导人肺腺癌细胞A549凋亡。Fas与Fas-L结合后，通过FADD的介导将凋亡信号传递给Caspase-8，激活Caspase-8产生一种连锁反应，导致Caspase-3的活化，产生死亡效应分子，诱导细胞凋亡。本研究提示上调Fas的表达，活化Caspase-3的活性，是姜黄素和奥沙利铂抑制胃癌BGC823细胞凋亡的重要机制之一。

姜黄素作为抗瘤新药毒性低、耐受性好、成本低廉，其与奥沙利铂的联合应用为肿瘤的化疗，可以使化疗毒副作用明显减少，治疗有效率提高，降低耐药性。

4 参考文献

1狄建彬,顾振纶,赵笑东,等.姜黄素的抗氧化和抗炎作用研究进展〔J〕.中草药,2010;5(2):35-6.

2石 峰,崔 平.姜黄素抗肿瘤作用机制研究进展〔J〕.肿瘤基础与临床,2011;24(6):547-9.

3Thiyagarajan S,Thirumalai K,Nirmala S,etal.Effect of curcumin on lung resistance-related protein(LRP)in retinoblastoma cells〔J〕.Curr Eye Res,2009;34(10):845-51.

4焦 鹏,王 慧,赵 鹏,等.亚硒酸钠抑制人胃癌BGC823 细胞的作用及其机制探讨〔J〕.营养学报,2011;33(6):571-4,579.

5Lorenzo HK,Susin SA.Therapeutic potential of AIF-mediated caspase-independent programmed cell death〔J〕.Drug Resist Updat,2007;10:235-55.

6Thorburn A,Behbakht K,Ford H.TRAIL receptor-targeted therapeutics:resistance mechanisms and strategies to avoid them 〔J〕.Drug Resist Updat,2008;11:17-24.

7Stewart JH,Nguyen D,Chen GA,etal.Induction of apoptosis in malignant pleuralmeso thelioma cells by activation of the Fas(Apo1/CD95)death signal pathway 〔J〕.J Thorac Cardiovase Surg,2002;123(2):295-302.

8Lee HS,Kim EJ,Kim SH.Chestnut extract induces apoptosis in AGS human gastric cancer cells 〔J〕.Nutr Res Pract,2011;5(3):185-91.

9季宇彬,张志坚,邹 翔.莱菔硫烷诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与Fas/FasL途径的相关研究〔J〕.中草药,2011;42(12):2489-91.

10曾呈军,胡金喜,卢晓东,等.姜黄素联合奥沙利铂对人胃癌细胞生长及其X连锁凋亡抑制蛋白表达的影响〔J〕.温州医学院学报,2011;41(4):315-20.

11杨春梅,崔晓博,张林西,等.姜黄素逆转耐药作用于Caspase-3关系研究〔J〕.实用医学杂志,2012;28(3):355-7.

12张 静,连超群,陈传好,等.姜黄素诱导A549细胞凋亡过程中活性氧水平和Caspase-3活性的变化〔J〕.中国老年学杂志,2011;31(11):2024-6.