人参皂甙Rg3联合槐耳颗粒对免疫抑制小鼠的免疫调节作用*

高慧婕 李春霞 刘树玲 刘 超 司传平

(济宁医学院基础学院，山东 济宁 272067)

人参皂甙Rg3 是从人参中提取的四环三萜类人参二型皂甙单体。研究表明，Rg3能显著提高小鼠免疫功能，可以减轻传统化疗毒副作用，提高其生存质量[1-2]。但由于人参皂甙Rg3提取困难，价格昂贵，对其实行单独应用造成了一定的限制。槐耳是我国民间重要的药用真菌，有治风、破血、益力的功效，民间多用于治疗癌症及炎症[3]。槐耳颗粒是一种新型的真菌类抗癌药物，主要成分为槐耳菌质多糖(PS-T)等多糖蛋白和氨基酸。基础研究表明，该药不仅能抑制肿瘤细胞的生长，还可增强机体免疫力，是一种较为理想的免疫增强剂[4-5]。本实验将两种药物联合应用，观察其对免疫抑制小鼠的免疫调节及免疫保护作用，并探讨联合应用是否具有协同免疫增强作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物 ICR清洁级小鼠雌雄各半，6～8周龄(体重18～22g)，购自郑州市华兴实验动物养殖场[合格证号：SCXK(鄂)2004-0007]。

1.1.2试剂及配制 注射用环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX，购自Aladdin公司,货号：C106991)；人参皂甙Rg3(购自Aladdin公司，批号：MUST-12041211)；金克槐耳颗粒(启东盖天力药业有限公司生产，批准文号：国药准字Z20000109)；PHA-P(购自Sigma公司,货号:L8754)；鸡红细胞由济宁医学院医学实验中心提供健康鸡，抽取其颈静脉血，4℃保存于灭菌过的Alsever 液中，用前以无菌生理盐水离心洗涤3次，配成一定比例的CRBC 悬液。豚鼠心脏采血，分离血清，将3只豚鼠新鲜血清混合，经CRBC吸收后作为实验补体来源，-20℃ 保存，备用。

1.1.3仪器 酶标仪(Thermo Labsystems公司)；SIGMA台式高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；SW-CJ-2F 双人医用净化工作台(苏州净化公司)；OLYMPUS CH30 显微镜(OLYMPUS公司) 。

1.2 方法

1.2.1试验动物分组及给药 ICR小鼠随机分成4组，每组20只。分别为：正常对照组、模型组、人参皂甙Rg3组、联合用药组(人参皂甙Rg3与槐耳颗粒合用)。除正常对照组外，其它各组小鼠于给药的第5、6、7天均每日腹腔注射CTX 40mg/kg造模[6]。正常对照组：腹腔注射等量的生理盐水；人参皂甙Rg3组：每日灌胃200mg/kg人参皂甙Rg3；联合用药组：每日灌胃100mg/kg人参皂甙Rg3和900mg/kg槐耳颗粒，每日1 次，连续7d。正常对照组和CTX 模型组采用等体积生理盐水灌胃，每日1 次，连续7d。

1.2.2小鼠免疫器官指数测定 于末次给药后次日，用电子天平精确称取小鼠体重，眼球摘除取血后，无菌条件下称取小鼠胸腺、脾脏的质量，根据公式计算脾脏及胸腺指数：脾脏( 胸腺) 指数= 脾脏( 胸腺) 质量/体重。

1.2.3小鼠腹腔吞噬细胞吞噬功能测定 小鼠分组、造模、给药均同上。在实验第5天每只小鼠腹腔注射可溶性淀粉蛋白胨溶液1ml，最后一次给药2h后，小鼠腹腔注射5%鸡红细胞悬液，每只0.5ml，并轻揉腹部。注射30min后，小鼠腹腔注射生理盐水2ml/只，并轻揉腹部数次，用注射器吸出小鼠腹腔液，取1滴于洁净的载玻片上，推成薄片，晾干后甲醇固定5min。滴加瑞氏—吉姆萨染液，染色5min，流水轻轻冲洗，自然晾干，油镜下观察。

1.2.4小鼠淋巴细胞转化实验 小鼠分组、造模、给药均同上。在灌胃开始后第5天每组小鼠肌肉注射PHA-P 8mg/kg·d。在最后一次给药2h后断尾取血、均匀涂片，晾干后吉姆萨染色15min，水洗，自然晾干，油镜下观察。

1.2.5小鼠血清溶血素测定 小鼠分组、造模、给药均同上。在实验第3天每组小鼠均腹腔注射5%的鸡红细胞进行初次免疫，最后一次给药2h后，摘眼球取血2ml，取血清20μl与1ml的生理盐水、4%的鸡红细胞0.5ml、10%的豚鼠血清0.5ml充分混合，立即置于37℃恒温水浴箱中，30min后立即取出，冰浴终止反应，冷却后3000r/min离心5min。取上清，用酶标仪于450nm波长测定OD值。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS17.0进行统计学处理。

2 结果

2.1 实验动物的一般情况及生存率

实验前，各组小鼠的体重、精神、摄食、活动以及皮毛色泽等状况均无异常。至第7天时，模型组小鼠普遍消瘦、精神萎靡、活动偏少，食量减少，体毛竖起、稀疏有脱落且缺乏光泽。人参皂甙Rg3组、联合用药组，小鼠活动基本正常，皮毛整齐有光泽，毛发脱落未及模型组明显。解剖后发现模型组小鼠肝脏有明显的坏死现象，而其它各组均少见到该现象。

2.2 对各组小鼠脾指数与胸腺指数变化

模型组小鼠脾指数及胸腺指数显著低于正常对照组(P<0.05)，表明CTX免疫抑制模型制备成功。与模型组比，人参皂甙Rg3组、联合用药组脾和胸腺指数均有不同程度的提高(P<0.05)，以人参皂甙Rg3与槐耳颗粒合用组提高更为明显。见表1。

表1 各组小鼠脾指数与胸腺指数的变化

*与正常对照组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.05；△与人参皂苷Rg3组比较，P<0.05

2.3 对各组小鼠腹腔吞噬细胞吞噬功能的变化比较

与正常对照组比较,模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数均显著降低(P<0.05)，说明造CTX免疫抑制模型制备成功。与模型组比较，人参皂甙Rg3组、人参皂甙Rg3与槐耳颗粒合用组均可显著提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数，且以人参皂甙Rg3与槐耳颗粒合用组效果明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠腹腔吞噬细胞吞噬功能的变化

*与正常对照组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.05；△与人参皂苷Rg3组比较，P<0.05。

2.4 各组小鼠淋巴细胞转化的变化

与正常对照组比，模型组小鼠外周血淋巴细胞转化率明显降低。与模型组比，人参皂甙Rg3组、联合用药组均可显著促进免疫抑制小鼠外周血淋巴细胞转化(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠淋巴细胞转化率的变化(%)

*与正常对照组比较，P<0.05；**与模型组比较，P<0.05；△与人参皂苷Rg3组比较P<0.05。

2.5 各组小鼠血清溶血功能的变化

与正常对照组比，模型组OD值显著下降(P<0.05)，说明成功建立CTX免疫抑制模型。与模型组比，人参皂甙Rg3组、联合用药组均可显著促进免疫抑制小鼠血清溶血素的形成,OD值显著升高(P<0.05)。见表4。

表4 各组小鼠血清溶血功能的变化

*与正常对照组比较，P<0.05；**与模型组比较P<0.05；△与人参皂苷Rg3组比较P<0.05。

3 讨论

胸腺系数和脾脏系数是检测机体免疫功能的重要指标，免疫功能低下时胸腺、脾脏萎缩，体积变小[7]。本文结果显示人参皂甙Rg3组、联合用药组均能明显提高模型组降低的胸腺指数和脾脏指数，以联合用药组效果更明显，提示槐耳颗粒可以加强人参皂甙Rg3对CTX抑制的免疫器官的保护作用。本实验选用巨噬细胞吞噬试验、溶血素试验、淋转试验测定小鼠免疫功能，观察药物对小鼠免疫功能的调节作用。结果显示人参皂甙Rg3与槐耳颗粒的联合应用可显著提高巨噬细胞的吞噬百分率及吞噬指数，促进溶血素的形成以及淋巴细胞的转化，提示槐耳颗粒可以进一步增强人参皂甙Rg3对CTX抑制小鼠的免疫保护作用。

治疗癌症的化疗药物严重地影响患者的生活质量。因此，治疗癌症的同时可以提高患者生活质量的药物受到越来越多的重视[8]。本实验将两种植物类抗癌及免疫保护药物的联合，结果表明槐耳颗粒对人参皂甙Rg3有良好的辅助、协同作用，可弥补人参皂甙Rg3单独应用的不足。一方面联合应用效果更好，另一方面也进一步克服了传统化疗药物的毒副作用，抗肿瘤的同时也能保护机体免疫功能，提高了患者的生存质量，为进一步的临床联合应用提供理论基础和依据。另外，我国人参、槐耳菌质资源丰富，可人工栽培，若能作为抗肿瘤药物和免疫保护药物进一步加以开发，将具有广阔的应用前景。

[1] 陈明伟,陈健,姚煜,等.人参皂甙20(R)-Rg3治疗肺癌的临床疗效观察[J].西安交通大学学报(医学版),2003,24(3):288-289.

[2] Iishi H,Tatsuta M,Baba M,et al. Inhibition by ginsenosideRg3 of bombesin-enhanced peritoneal metastasis of intestinal adenocarcinomas induced by azoxymethane in Wistar rats[J]. Clin Exp Metastasis,1997,15(6):603-611.

[3] 徐华祥,朱小东,孔令群,等.槐耳清膏抑制肝癌切除术后复发瘤的生长及机制[J].中华实验外科杂志,2010,27(10):1445-1447．

[4] 季德林,麦大海.槐耳颗粒对胃癌术后同步放化疗患者生存质量和免疫功能的影响[J].中国肿瘤,2010,19(1):73-76．

[5] 施丽飞,薛大方,郝爱国,等.3种抗肿瘤中成药中10种人体必需微量元素的含量分析[J].中国中医药科技,2007,14(3):181-182．

[6] 杨宪勇.应用环磷酰胺构建C57BL/6J小鼠免疫抑制模型[J].中国组织工程研究,2012,16(40):7486-7490.

[7] Di I M,Del P B,De I M,et al. Mesenchymal cells recruit and regulate T regulatory cells[J]. Exp Hematol,2008,36:309-318.

[8] O’Shaughnessy J A,Wittes R E,Burke G,et al. Commentary concerning demonstration of safety and efficacy of investigational anticancer agents in clinical trials[J].J Clin Oncol,1991,9(12):2225-2232.