白僵菌施加对水稻三种抗氧化酶活力及叶际微生物多样性的影响

杜 威，江 萍，王彦苏，吕立新，王宏伟，卜元卿，刘常宏，戴传超,*

(1. 南京师范大学生命科学学院， 江苏省微生物资源产业化工程技术研究中心，江苏省微生物与功能基因组学重点实验室，南京 210023； 2. 环境保护部南京环境科学研究所，南京 210042；3. 南京大学生命科学学院，南京 210093)

白僵菌是一种典型的杀昆虫真菌，作为一种微生物农药在全世界广泛使用[1]，白僵菌能够寄生在多种昆虫体内并产孢[2]，它可以拮抗许多植物茎内和叶际病原菌如灰霉病菌[3]、立枯丝核菌[4]等，除了能够抑制病原菌菌丝生长，还能诱导多种病原菌的细胞裂解[5]。目前已经报道白僵菌可以成为很多植物的内生菌，例如其在可可豆[6]、咖啡幼苗[7]、玉米[8]中共生，也有研究表明其可以在一些树种如西部白松[9]、椰枣[10]等树中共生。

国内外关于白僵菌的研究集中于其杀虫机制以及与植物体的共生、拮抗病原菌等。对于其在土壤和叶际微生态系统中的行为研究较少，李永利等研究发现低温、壤土及土壤含水量为15%的条件下有利于白僵菌的宿存[11]，王滨等研究了白僵菌在土壤中的宿存情况，发现前2个月内处于波动状态，随后下降较快，但在宿存过程中产孢量不受影响[12]。但是在叶际微生态系统中白僵菌的残留以及其对叶际微生态系统和植物本身的生理水平影响的研究几乎没有。在植物叶际生存的微生物称为叶际微生物[13]，对叶际微生物的研究远落后于根际微生物的研究[14]，而叶际微生物作为一类重要的群体具有固氮[15]，抵御病害[16]及改变宿主微环境等功能，对外界变化也较敏感，因此研究白僵菌施用后对植物叶际的微生物群落结构、植物生理代谢水平影响及其在植物叶际的残留动态对于评价微生物农药白僵菌的生物安全性有重要意义。

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等3种抗氧化酶类能够有效的反映植物的生理代谢水平变化，可作为评价外界环境条件变化对植物生理代谢影响的指标。微生物群落结构变化也可作为评价外界环境变化影响的指标。目前，广泛利用分子生物学手段进行环境风险评价[17]，由于传统涂布平板法的局限性，DGGE作为一种分子生物学手段能够有效的反映环境中微生物群落结构的变化。

实时定量PCR 技术定量检测环境中某种特定微生物的特异性和灵敏度都很高,目前已被作为一种成熟的技术手段用于微生物生态学研究[18- 20],选择合适的靶序列将决定PCR检测的特异性和灵敏度，从而精确的对某种特定微生物定量[21- 23]。本文获得了1株有绿色荧光蛋白标记并能组成性表达的白僵菌菌株[24]，该基因是以整合到质粒中的形式存在并转化到白僵菌菌株中，在无筛选压力下可以稳定遗传。针对绿色荧光蛋白序列设计了一对特异性引物,建立了快速定量检测水稻叶际白僵菌残留的实时定量PCR 方法。由于白僵菌和化学农药乙酰甲胺磷均对水稻害虫二化螟有防治作用，因此本实验在对水稻植株接种二化螟幼虫的基础上研究了不同浓度的白僵菌孢子悬液及化学农药对水稻叶际微生物区系及水稻保护酶系统的影响，评价白僵菌的生物安全性并在同一体系中比较生物农药和化学农药的生态影响，为白僵菌的使用提供指导和参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

(1)供试土壤 供试盆栽土壤取自南京师范大学植物园，土壤pH值5.97，有机质1.08%，总氮1.21 g/kg，速效氮98.64 mg/kg，总磷0.39 g/kg，速效磷24.67 mg/kg，总钾0.73 g/kg，速效钾67.58 mg/kg。

(2)供试水稻(Oryzasativa) 水稻品种为武育粳D1，购于江苏省农业科学院。

(3)供试二化螟(Chilosuppressalis) 二化螟幼虫由南京农业大学高建芬副教授赠送。

(4)供试白僵菌(Beauveriabassiana) 白僵菌菌株Bb0062 (带有草丁膦抗性标记基因bar和表达绿色荧光蛋白基因egfp)由西南农业大学裴炎教授赠送；将GFP标记的白僵菌菌株进行扩繁处理，并进行荧光检测，确定该白僵菌有很强的荧光活性。将平板上培养好的白僵菌刮取孢子并用无菌去离子水清洗并制成不同浓度孢子悬液用于实验。

(5)供试化学农药 化学农药为乙酰甲胺磷，购于农药市场。

1.2 实验设计

盆栽试验地点在南京师范大学植物园。试验共设7个处理，各6次重复。处理分别为CK (空白)、A (接种二化螟幼虫)、B (1倍，即白僵菌施用浓度7.5×104孢子/mL)、C (10倍)、D (100倍)、E (1000倍)和F (化学农药)处理组(除空白处理组外均接水稻害虫二化螟幼虫)，白僵菌处理组每盆喷洒白僵菌孢子悬液40 mL，化学农药施用量按说明操作。试验用桶高70 cm，桶口直径30 cm，每桶放置过筛土20 kg。2012年5月1日育苗，待幼苗长至10—15 cm高时将其移秧至新桶中，每桶4穴。整个盆栽试验期间，视土壤含水量状况不定时灌浇自来水，定期拔除杂草。各处理组用3 m × 0.7 m × 1.5 m防虫网遮盖并用竹竿固定。于7月10日接种二化螟幼虫并施用白僵菌孢子悬液和化学农药。

分别在喷施当天，喷施后第10、30天和第60天，带无菌手套，采用打孔器采集水稻叶片，每个重复约5—6g叶片立即放入无菌样品袋中并进行实验。从同一处理的每个重复中各取1 g均匀混合并提取叶际总基因组，各重复的剩余部分去除叶脉后取0.5 g单独进行酶活力的测定。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 白僵菌绿色荧光蛋白的引物设计

使用Primer 5.0设计引物(eGFP-F1/eGFP-R1)扩增标记白僵菌的绿色荧光蛋白的一段序列，PCR产物为289 bp。上下游引物序列分别是(eGFP-F1: 5′CAGTGCTTCAGCCGCTACCC3′, eGFP-R1: 5′AGT-TCACCTTGATGCCGTTCTT3′)。

1.3.2 实时定量PCR

实时定量PCR 扩增使用Step OneTM(ABI，USA)定量PCR 仪。荧光定量标准曲线使用梯度稀释的白僵菌基因组DNA为模板。PCR 扩增反应为25 μL体系:2 μL DNA 模板,上下游引物各1 μL,10 μL SYBR PremixExTaq, ROX 0.4 μL,H2O 6 μL。扩增反应程序: 94℃预变性5 min；94℃ 30 s，60℃ 50 s，40 个循环。所有的荧光定量PCR反应条件和体系完全一致。

1.3.3 POD、SOD、CAT 3种酶活力测定

水稻叶片的POD、SOD、CAT 3种酶活力的测定使用南京建成公司试剂盒，其活性以每mg可溶性蛋白的催化活力U表示。

1.3.4 叶际微生物的分离及DNA提取

叶际微生物的分离方法参见文献[25]，提取后的菌体沉淀使用Ultra CleanTMSoil DNA Isolation试剂盒(Mo BIO Laboratories) 提取DNA，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.5 PCR 扩增和变性梯度凝胶电泳(DGGE)

DNA 的PCR 扩增条件见表1,反应体系均为50 μL体系：10×PCR 缓冲液5μL，MgCl23.5μL (20 mmol/L)，dNTP 2μL (10 mmol/L),上下游引物各1μL (10 μmol/L)，TaqDNA 聚合酶(REGEN BIOTEC公司)0.3 μL (1.5 U)，DNA模板1 μL (15 ng)，无菌超纯水36 μL。PCR 产物用1%的琼脂糖凝胶检测。使用CBS-DGGE 电泳系统(CBS Scientific Co.)进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，聚丙烯酰胺凝胶浓度和变性梯度见表1，电泳缓冲液为1×TAE，PCR 产物上样量为500 ng，60 ℃，100 V 电泳12 h，EB 染色20 min，UVP 凝胶影像分析系统拍照。

表1 PCR-DGGE条件

1.4 数据处理

实验结果用算术平均数±标准误表示，应用SPSS 13.0 软件进行方差分析，(One-Way ANOVA) 检验处理间差异显著性，并用Duncan 法进行多重比较，当P<0.05 时，各个处理间存在显著差异。使用Excel 2007 进行作图。

DGGE 指纹图谱使用Gelcompar Ⅱ 软件分析。其中，聚类分析使用UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic averages) 方法。用于计算群落生物多样性的指标有：

(1) Shannon 指数H=-∑(ni/N) ln(ni/N)

式中,ni为单一条带的峰面积；N为所有峰的总面积。

(2) 条带数量S，为所在泳道的条带总数目。

2 结果与分析

2.1 荧光定量PCR检测白僵菌在水稻叶际的残留

2.1.1白僵菌绿色荧光蛋白特异性引物设计及验证

通过对白僵菌绿色荧光蛋白序列的扩增效果及特异性验证筛选了一对合适的引物eGPF-F1 (5′-C AGTGCTTCAGCCGCTACCC - 3′)/eGFP-R1(5′-AGTTCACCTTGATGCCGTTCTT- 3′)。从图1中可以看出，使用eGPF-F1/eGFP-R1进行常规PCR反应，可以得到单一的扩增条带。

图1 使用引物eGPF-F1/eGFP-R1扩增产物的电泳图谱

2.1.2 白僵菌定量PCR标准曲线制备

荧光定量PCR扩增反应使用梯度稀释的白僵菌基因组DNA做为模板，引物为eGPF-F1/eGFP-R1。图2为白僵菌基因组荧光定量标准曲线，横坐标(x)为模板质量，纵坐标(y)为达到荧光阈值的循环数量即Ct值(y= -3.603x+28.351)。标准曲线的相关系数(R2>0.99)，这表明白僵菌基因组DNA质量在10-1—103pg之间能够很好地线性定量扩增。同时，将白僵菌基因组DNA继续稀释至10-2pg、10-3pg、10-4pg、10-5pg、10-6pg，用1 μL超纯无菌水作对照进行扩增，研究该方法的检测极限，1 fg/μL白僵菌基因组DNA为模板及1 μL超纯无菌水代替DNA模板做为阴性对照均未能扩增，表明该体系的检测下限为10 fg/μL白僵菌基因组DNA质量，能够满足一般检测需要。

图2 白僵菌基因组实时定量PCR 标准曲线

2.1.3 水稻叶际白僵菌残留量的跟踪检测

从CK、A、B、C、D、E、F总共7个处理中分别提取叶际总DNA，进行定量PCR。在所有的采样时间点，CK、A、F处理中都没有检测到白僵菌的存在，说明在实验处理中及后续时期白僵菌并未污染此3组处理，能够更好的进行各处理组之间的比较。由图3可以看出，在分别喷施1倍、10倍、100倍、1000倍白僵菌孢子悬液的B、C、D、E处理组中，在喷施后的第0、10、30天内均检测到了白僵菌的存在，而在第60天时4个处理组中均未检测到白僵菌的存在，说明白僵菌可以在水稻叶片残留至少达30 d之久。其中1000倍白僵菌处理即E处理组叶际白僵菌DNA含量在第0天为log102.93 (pg DNA/g叶片)，而在第30天时为log100.69 (pg DNA/g叶片)，衰减了99.42%，而D、C、B处理组的叶际白僵菌含量分别衰减了97.91%、92.41%、74.30%。说明了白僵菌喷施浓度越大，衰减速度越快，因此在喷施时应注意浓度不用过大，以免造成不必要浪费。

图3 定量PCR研究水稻叶际白僵菌DNA 含量变化

2.2 白僵菌对水稻酶活力影响

2.2.1 白僵菌对水稻超氧化物歧化酶活力影响

超氧化物歧化酶SOD是目前为止发现唯一以超氧阴离子自由基为底物的酶，对于维护植物体内动态平衡起着重要作用[26]，具有防御活性氧毒性等功效。由图4可知，超氧化物歧化酶活性在整个周期中随着时间的延长逐渐降低。白僵菌处理能提高水稻超氧化物歧化酶活性，其中以10—30 d效果最为明显，在第10天时D处理组相比较CK提高了20.38%，而A处理组相比较CK略有下降，推测二化螟虫害导致水稻酶活力下降，到成熟期，各处理组超氧化物歧化酶活力趋于一致。

图4 不同处理对SOD活性的影响

2.2.2 白僵菌对水稻过氧化物酶活力影响

过氧化物酶主要起到酶促降解H2O2的作用，解除细胞内有害自由基。由图5可知，过氧化物酶活性在整个周期中呈现逐渐上升的趋势，到第60天时达到最大值。白僵菌对过氧化物酶活力影响较小，在第10天时，F处理组水稻过氧化物酶活力较高，推测是由于植物的应激反应所导致。

图5 不同处理对POD活性的影响

2.2.3 白僵菌对水稻过氧化氢酶活力影响

过氧化氢酶CAT可以分解H2O2形成O2和H2O，与植物代谢强度及抗逆能力密切相关[27]。由图6可以看出，在整个周期内随着时间延长，过氧化氢酶活力逐渐下降。F和A处理组过氧化氢酶活力较低，推测病虫害及化学农药均会降低过氧化氢酶活力，其中在第10天 时，A和F处理组相比较CK分别下降了19.55%和42.70%，化学农药处理导致酶活力下降幅度更大，在第30天 时4个白僵菌处理组过氧化氢酶活力均提高，其中C处理组相比较CK提高了33.67%，而在第60天 时，A处理组酶活力仍未恢复。

图6 不同处理对CAT活性的影响

2.3 白僵菌对水稻叶际微生物群落结构的影响

2.3.1 水稻叶际细菌DGGE分析

由图7和表2可以看出，白僵菌对水稻叶际细菌群落结构影响较小，但聚类分析表明在同一时期内各处理组聚成一类，说明细菌群落结构随时间具有一定波动性，而同一时期内各白僵菌处理组之间细菌群落结构较相似，相比较其他处理组，条带数及香农指数有所提高。

图7 水稻叶际细菌群落DGGE指纹图谱聚类分析

2.3.2 水稻叶际真菌DGGE分析

由图8和表3可知，真菌的群落结构变化表现出与细菌相似的特点，即同一时期的各处理组聚成一簇，而白僵菌处理组群落结构较类似，并且在后期条带数及香农指数相比较其他处理组有所提高。A处理组和F处理组条带数及香农指数均较小。

图8 水稻叶际真菌群落DGGE指纹图谱聚类分析

表2 叶际细菌群落多样性

表3 叶际真菌群落多样性

3 讨论

虽然微生物农药白僵菌应用较广泛，但国内外目前尚没有关于白僵菌对植物叶际影响的研究。本文首次对微生物农药白僵菌在叶际的生态影响做了较为全面的评价，并首次在同一系统中比较了生物农药白僵菌与化学农药对植物叶际的不同生态影响。

3.1 白僵菌在环境中的残留

生防菌能否起到稳定、持久的防病效果的重要因素就是其在植物根际能否有效定殖[28]。而研究生防菌在叶际的定殖对于评价其作用效果也至关重要。微生物农药在施用后面临着衰减残留情况的检测问题，传统抗生素标记及放射性同位素标记等技术手段难以直观、准确区分土著微生物和人工接种微生物[29]，绿色荧光蛋白作为分子标记应用较广，其对细胞无毒，结构稳定[30]，但是荧光表达需要一定条件，在胁迫、寡营养阶段或特殊生长阶段也会出现荧光表达较弱的问题。本文建立了一种使用SYBR Green I 荧光染料快速检测叶际白僵菌残留的方法。SYBR Green I 的特异性主要依靠设计的PCR 引物的特异性。根据白僵菌绿色荧光蛋白序列设计了一对特异性引物eGFP-F1和eGFP-R1，验证特异性、灵敏性均较高，结果表明白僵菌可以在水稻叶际残留至少达30 d，本研究在试验期间受多次的降水、大风的气候因素的影响，推测白僵菌能够与水稻由附生转变为半寄生状态。殷幼平等研究发现绿色荧光蛋白标记的枯草芽孢杆菌在柑橘叶际定殖达42 d之久[31]，然而并未比较不同浓度的生防菌衰减速率，本文研究发现白僵菌初始喷施浓度越大，其在叶际的衰减速率越快，其中在第30天时B处理组白僵菌残留量是初始量的25.70%，而E处理组白僵菌残留量是初始量的0.58%。

3.2 白僵菌对水稻抗氧化酶活力研究

SOD、POD、CAT作为保护酶系统的主要指标，能够反映植物的生理代谢水平。而目前国内外针对植物保护酶系统的影响因素研究主要局限于化学农药[32]、重金属离子[33- 34]、内生菌[35]、盐胁迫[36]、矿质元素[37]等，关于微生物农药对植物保护酶系统的影响研究较少。本文研究发现白僵菌处理能够提高水稻超氧化物歧化酶及过氧化氢酶活力，并且不同浓度白僵菌处理组之间酶活力相差较小，白僵菌能够与植物互作，改善植物生长状态，推测一方面白僵菌可以拮抗植物病原菌、诱导植物抗性[38- 39]及毒杀水稻害虫二化螟，另一方面白僵菌可能影响水稻土壤从而间接改善植物生长条件，然而具体机制目前还不清楚。在A处理组即接种二化螟处理组中，3种保护酶活力均有不同程度下降，推测保护酶活力下降是由水稻虫害导致的。在F处理组即化学农药处理能够降低水稻过氧化氢酶活力，对其他两种酶活力影响较小，推测是化学农药引起了植物的应激反应。

3.3 白僵菌对水稻叶际微生物群落结构的影响

总体来看，白僵菌处理并未造成叶际细菌群落较大波动。在真菌群落结构中，A、F处理组条带数及香农指数均较小，说明水稻病虫害及化学农药对真菌群落结构有较大影响。在第10天时，化学农药处理后细菌及真菌多样性均较小，这与荆梦[40]等研究结果是一致的，推测由于化学农药导致某些抗药性菌群生长而抑制其他菌群的生长，从而导致叶际菌群结构较单一。

4 结论

本文建立了定量检测植物叶际白僵菌残留的荧光PCR方法，结果表明灵敏性及特异性均较高，白僵菌可以在水稻叶际残留达30 d之久，而白僵菌是以何种方式与水稻互作尚不清楚，同时白僵菌是否可以进入水稻叶片内部甚至由叶片迁移到茎、根等部位也是值得研究的。另外本文研究了白僵菌对水稻保护酶活力的影响，而白僵菌是以何种机制提高水稻保护酶活力还有待阐明。最后，本文研究了白僵菌对水稻叶际的微生物群落结构影响，DGGE聚类分析结果表明白僵菌处理后水稻叶际细菌、真菌的条带数和香农指数均有所升高说明白僵菌对水稻叶际微生物群落结构有一定影响，而白僵菌作用于水稻后对水稻内生菌的定殖是否影响也是值得研究的，只有阐明以上问题，才能更好的理解白僵菌的作用机制，更充分的评价微生物农药白僵菌的生物安全性。

致谢：西南大学生物技术中心裴炎教授提供绿色荧光蛋白标记的白僵菌菌种，南京农业大学植物保护学院高建芬副教授提供二化螟幼虫,特此致谢。

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