漆黄素联合胡椒碱的抗抑郁作用及其机制研究

王钱东+吴淑娟+朱国文+潘建春

[摘要] 目的 探讨低剂量漆黄素（Fisetin）联合阈下剂量胡椒碱的抗抑郁作用是否涉及单胺机制。 方法 采用行为绝望抑郁模型，即小鼠强迫游泳实验和悬尾实验，观察低剂量漆黄素与阈下剂量胡椒碱急性给药对小鼠绝望模型不动时间的影响，同时观察两药联用对小鼠自主活动的影响。高效液相-电化学检测脑区中单胺递质的含量，荧光分光光度法检测单胺氧化酶（MAO）活性。 结果 漆黄素（1.25 mg/kg， 2.5 mg/kg， 5 mg/kg， ig）与阈下剂量胡椒碱2.5 mg/kg·ip联合应用能显著减少小鼠强迫游泳和悬尾实验中的不动时间，且实验剂量范围内药物不影响小鼠的自主活动。低剂量漆黄素与阈下剂量胡椒碱合用能升高海马、皮层和杏仁核中的单胺递质水平同时降低脑内的MAO活性，并且具有统计学意义。 结论 低剂量漆黄素与阈下剂量胡椒碱联合用药能改善抑郁症样行为，该机制可能是通过抑制单胺氧化酶的活性，从而增加相关的神经递质。

[关键词] 漆黄素；胡椒碱；抑郁症；单胺递质；单胺氧化酶（MAO）

[中图分类号] R964 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）25-0001-06

抑郁症会影响身心健康，是一个常见且严重的精神障碍。抑郁症患者目前约占世界人口的21%[1]，其主要症状是降低语言功能、运动迟缓等。目前，临床上使用的抗抑郁药物主要有三类：单胺氧化酶（MAO）抑制剂，经典的三环类抗抑郁药药物，选择性5-HT重摄取抑制剂5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂[2，3]。因为这些药物只有约65%的患者有一定的作用，且有药效不稳定、毒副作用大、起效时间长等缺点。因此寻找新型的高效低毒药物作为抗抑郁的治疗非常的重要。

漆黄素（Fisetin，又名非瑟酮）是一种多酚类化合物，其含量在草莓中最高[4]。有文献报道，漆黄素具有保护和促进神经细胞再生作用并且可以改善动物的学习记忆能力[5，6]。此外，C6胶质瘤细胞，漆黄素抑制单胺氧化酶（MAO）活性亚型，它可以调节细胞内的脑儿茶酚胺和5 - 羟色胺（5-HT）含量的作用。胡椒碱是胡椒的主要成分，具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等药理作用，目前已经有胡椒碱的研究表明，其具有较强的抗抑郁活性，这可能与大脑酶单胺[7]（单胺氧化酶，MAO）的活性有关。文献报道，胡椒碱能够通过减慢白藜芦醇的代谢和延长其在体内的时间来增强多酚类化合物白藜芦醇的生物效应[8]。库尔卡尼和姜黄素和胡椒碱的其他建议结合能显著增强姜黄素[9，26]的抗抑郁作用。

本研究首先提出了漆黄素和胡椒碱的联合应用，探讨其联用的抗抑郁机制，同时说明联用是否能降低漆黄素的用药剂量，来达到单用时的效果，从而提高漆黄素的生物利用度，为开发新一代的高效低毒天然抗抑郁药物提供一条新的思路。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

漆黄素和氟西汀均购自美国Sigma公司；吗氯贝胺购自中国药品生物制品检定所。漆黄素、吗氯贝胺和氟西汀均用蒸馏水溶解，漆黄素和吗氯贝胺均灌胃给药，氟西汀腹腔给药。联合用药的给药方式为：先灌胃给予漆黄素（1.25 mg/kg， 2.5 mg/kg 和5 mg/kg），45 min后再分别腹腔注射胡椒碱（2.5 mg/kg），15 min后进行测试；在预实验中，给予胡椒碱和蒸馏水的小鼠在悬尾和强迫游泳不动时间上没有明显差异，所以在正式实验中仅用胡椒碱作为对照组。

1.2实验仪器

BS-11OS型电子分析天平，北京赛多利斯天平有限公司；WH-966漩涡混合器，太仓市科教器材厂；DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Bio-RAD 680酶标仪，美国伯乐公司；RF-5301PC型荧光分光光度计，日本岛津公司；JY92-2D超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 实验动物

雄性ICR小鼠，体质量为20～25g，购自温州医科大学实验动物中心。小鼠随机分组，8只/笼，室温（25±1）℃，湿度（50±10）%，自然光照，自由摄食饮水条件下进行实验。开始实验之前先适应5d。小鼠随机分组：正常对照组（Pip 2.5 mg/kg）、联合给药组（Pip 2.5 mg/kg+Fisetin 1.25 mg/kg， 2.5 mg/kg，5 mg/kg ）、氟西汀组（10 mg/kg）和吗氯贝胺组（20 mg/kg ）。吗氯贝胺组用于MAO活性的测定。

1.4 小鼠悬尾实验[10]

小鼠末次给药后，在小鼠的尾巴末端用医用胶带固定，然后将此悬挂在小鼠悬尾测试仪器中（其悬挂高度为50 cm）。观察小鼠在6 min内的行为并记录最后4min内小鼠的不动时间。小鼠的不动时间标准：小鼠倒挂在仪器中表现为完全不动。

1.5 小鼠强迫游泳实验[11]

在测试前24h，将小鼠放在一个装有水的圆形玻璃容器内，水的深度为10 cm，水的温度为24 ℃～25 ℃（圆形玻璃容器的规格：高25 cm；直径10 cm）进行强迫游泳训练，时间为15 min。24 h以后再次给药，然后将小鼠再次放入玻璃圆缸内做强迫游泳6 min，观察并记录后4 min小鼠的强迫游泳的不动时间。不动时间的标准为：小鼠停止挣扎浮在水中保持不动，或仅仅做一些必要的轻微动作保持头部浮在水面上。

1.6 小鼠自发活动[12]

小鼠末次给药以后，将小鼠放进自主活动箱的测定小室里，先适应5min，然后纪录小鼠在活动室的活动情况，记录时间为10 min。小鼠自发活动的记录标准：小鼠的爪子接触或离开底部的不锈钢横栅时产生的与小鼠自主活动成比例的电脉冲，这些电脉冲直接转换成小鼠的活动次数显示在数据窗中。

1.7 小鼠脑内单胺递质及其代谢产物含量测定[13]

给药后（漆黄素， ig；氟西汀或胡椒碱， ip），将小鼠快速断头处死，按照小鼠脑图谱在冰板上迅速分离出双侧的海马、额叶皮层和杏仁核，称重后放入-80℃冰箱中保存。按照每100 mg脑组织中加入200 μL冰冷的 0.4 mol/L HClO4溶液（溶液A），然后在冰上进行超声匀浆，接着4℃暗处静置60min，低温快速离心20 min（12，000 rpm，4 ℃），取上清液，加入上清液1/2量体积的B液，混匀，4℃暗处静置60 min，再次低温高速离心20 min（12，000 rpm，4℃），丢弃沉淀。样品上清液经过滤器过滤处理后（过滤器的孔径大小为0.22 μm），取20 μL自动进样。本实验采用的色谱柱为Diamonsilim C18（规格：150 mm×4.6 mm ID， 5 μm），流动相配方：125 mmol/L 枸橼酸-柠檬酸钠缓冲液（pH = 4.3）0.1 mmol/L EDTA， 1.2 mmol/L辛烷基磺酸钠，16%甲醇。流动相配置：按照以上的流动相配方称取药品，放入容器中，溶解均匀后用容量瓶定容，然后用0.22μm滤膜过滤，超声20 min后进行实验。流动相的流速为1.0 mL/min 。采用电化学检测器进行检测，脑组织中单胺及其代谢产物的含量以ng/g 湿组织重表示。

1.8 小鼠单胺氧化酶活性的测定[13]

小鼠末次给药以后快速断头处死，分离出脑组织，然后称重放入EP管中，将此EP管插入小碎冰里，接着在EP管中加入冰冷的4 mL磷酸缓冲液（pH = 7.8， 0.05 mol/L ），防止组织里单胺氧化酶活性降解，所有的操作都必须在冰上操作。然后在冰上进行匀浆制成脑组织匀浆液，接着在2.5mL磷酸缓冲液中加入20%曲通0.4 mL与组织匀浆液0.2 mL，涡旋器混匀，然后在38 ℃孵育箱中预孵育10 min， 加入30 μL 2.19 mmol/L 底物（终浓度为22 μmol/L），37 ℃孵育箱中孵育30 min，再加入0.2 mL 5 mol/L 高氯酸溶液，冷却后并离心（1500× g，10 min），取出0.5 mL上清液，然后加入浓度为1 mol/L 氢氧化钠溶液 2.5 mL，混匀并使用荧光分光光度计测定产物4-氢喹啉的荧光强度。单胺氧化酶的活性以nmol/（30min ·mg） protein表示。本实验中的组织蛋白浓度采用Bradford法来测定。

1.9 统计学处理方法

数据采用SPSS16.0统计软件包进行统计学处理，计量资料以均数±标准差表示，药物作用及其组间差异采用单因素方差（One-way ANOVA）方法分析中的Dunnett t检验分析，当P < 0.05时 视为有统计学意义。

2 结果

2.1 漆黄素和胡椒碱联合用药在小鼠悬尾实验中的作用

结果图1显示，与空白对照组相比，小鼠悬尾实验中漆黄素和胡椒碱联合用药组（Pip + Fisetin 1.25 mg/kg，2.5 mg/kg，5 mg/kg，）可以减少小鼠悬尾实验中的不动时间，具有统计学意义[F（4，35）=3.361，P=0.02<0.05 ]。阳性对照药氟西汀组能显著减少不动时间。

2.2 漆黄素和胡椒碱联合用药在小鼠强迫游泳实验中的作用

结果如图2显示，在强迫游泳实验中，与空白对照组相比，漆黄素和胡椒碱联合用药组（Pip+Fisetin 1.25 mg/kg，2.5 mg/kg，5 mg/kg ）可以减少小鼠强迫游泳实验中的不动时间，具有统计学意义[F（4，35）=3.794，P=0.011<0.05]。其作用效果与阳性对照样氟西汀相似。

2.3漆黄素和胡椒碱联合用药在小鼠自发活动中的作用

实验结果如图3所示，与空白对照组相比，在自发活动中，漆黄素和胡椒碱联合给药组（Pip+ Fisetin1.25 mg/kg，2.5 mg/kg，5 mg/kg）没有明显差异，从这个结果得出可以排除药物的假阳性结果。

2.4 小鼠脑内单胺递质及其代谢产物含量的变化

如表1所示，在小鼠海马中，与空白对照组相比，漆黄素和胡椒碱联合用药组（Pip + Fisetin 2.5 mg/kg， Pip + Fisetin 5 mg/kg，ig）和氟西汀组（10 mg/kg， ip）均增加海马中5-HT的含量，具有统计学意义[F（4，35）=5.170， P=0.0006<0.01]；去甲肾上腺素水平也增加，具有统计学意义[F（4，35）=4.312，P=0.002<0.01] 。

如表2所示，在额叶皮层中，与空白对照组相比，漆黄素和胡椒碱联合用药组（Pip + Fisetin 2.5 mg/kg ， Pip + Fisetin 5 mg/kg， ig）和氟西汀组（10 mg/kg， ip）增加5-HT的含量，具有统计学意义[F（4，35）=3.968， P=0.036<0.05]；去甲肾上腺素水平也增加，具有统计学意义[F（4，35）=3.411， P=0.04<0.05）]。

如表3所示，在杏仁核中，与空白对照组相比，漆黄素和胡椒碱联合用药组（Pip + Fisetin 2.5 mg/kg， Pip + Fisetin 5 mg/kg，ig）和氟西汀组（10 mg/kg，ip）均增加5-HT的含量，具有统计学意义[F（4，35）=4.668， P=0.002<0.01 ]；去甲肾上腺素水平也增加，具有统计学意义[F（4，35）=3.156， P=0.014<0.05] 。

2.5 漆黄素和胡椒碱联合用药对小鼠单胺氧化酶活性的影响

结果如表4所示，与空白对照组相比，漆黄素和胡椒碱联合用药组（Pip + Fisetin1.25 mg/kg，2.5 mg/kg，5 mg/kg）能够抑制单胺氧化酶A的活性，并且具有统计学意义[F（4，35）=4.199，P=0.0028<0.01] ，但是对单胺氧化酶B没有作用。此结果和单胺氧化酶A抑制剂吗氯贝胺的作用相似。

3讨论

许多研究表明，抑郁症具有一定的遗传性，临床研究显示大概40%～50%抑郁症患者来源于基因的遗传，但是抑郁症发病机制复杂，其涉及到机体交感神经、免疫系统和内分泌系统等多个方面。目前研究表明通过药物的联合应用来治疗抑郁症具有以下优势：减少药物临床不良反应，戒断综合征[14，15]以及对心理的伤害作用，快速地提高药物疗效。本研究从2011年1月～2013年12月份采用漆黄素和胡椒碱的联合应用，从行为学、分子生物学的角度来阐明联合用药的药理效应及其作用靶点。

当人类处于无法改变的恶劣环境条件下，抑郁症患者更加倾向于表现出消极状态。在抗抑郁样作用的研究中，行为学实验具有重要的作用，小鼠悬尾实验和小鼠强迫游泳实验是评价抑郁样行为的经典模型，通过观察其不动时间可以确定药物的抗抑郁样效应并且确定其作用靶标[16，17]。本实验的结果表明，漆黄素与胡椒碱联合应用能显著减少小鼠在悬尾实验（TST）和强迫游泳实验（FST）的不动时间，说明漆黄素和胡椒碱联合应用具有抗抑郁样作用。并且本实验发现与单用各个剂量的漆黄素相比，本研究中结果未显示，Pip 2.5 mg/kg+Fisetin 5 mg/kg的联合应用与单用Fisetin（20 mg/kg）的抗抑郁样行为效果相当，说明阈下剂量的胡椒碱能增强漆黄素的抗抑郁活性。同时，为排除药物中枢兴奋作用造成的假阳性结果，本研究观察了漆黄素和胡椒碱的联合应用对小鼠自主活动的影响。结果显示，在产生抗抑郁样作用的剂量范围内，该联合用药对小鼠自主活动次数没有明显影响，可排除假阳性的结果，进一步证实漆黄素和胡椒碱联合用药的抗抑郁作用。

大量研究表明，抑郁症患者体内5-羟色胺和儿茶酚胺类神经递质的降解增加，从而在体内的表达减少。现代神经生物学的近期研究发现，应激诱导的大鼠抑郁模型中额叶皮层体积的缩小和突触相关蛋白表达的减少与脑区中5-HT及5-HT受体的异常密切相关[18]。另外，一些抑郁症的表现如对于主动或者积极应对的行为减少以及被动或者消极应对的行为增加，这些表现与去甲肾上腺素（NE）和5-羟色胺（5-HT）的含量密切相关。5-HT是人体内的神经递质，其在生理和病理过程中具有重要的作用，如调节情绪、学习、睡眠和性行为等，这些在重型的抑郁症患者中都能表现出异常特征。另外，慢性应激引起的抑郁样行为学的改变（认知和行为发生障碍）与脑内5-HT神经递质的变化密切相关[19]。文献报道通过减少脑区内5-HT的降解，激动5-HT受体，提高胞内AC-cAMP的活性和CREB活性具有改善抑郁样的作用[20]，因此5-HT在发挥抗抑郁样作用中具有重要的作用。前期研究表明漆黄素可以通过抑制单胺氧化酶活性来增加脑内的单胺递质水平，从而来改善抑郁样行为学的改变[21]。但是漆黄素的生物活性比较低，同时胡椒碱是一种生物活性增强剂，能提高其他药物的生物利用度。因此本实验通过观察脑区的单胺递质水平的变化来寻找其联合用药的作用靶标，结果发现，低剂量漆黄素（2.5 mg/kg和5 mg/kg）与阈下剂量胡椒碱合用能剂量依赖性提高小鼠海马、额叶皮层和杏仁核的5-HT水平，这与阳性对照药氟西汀的结果相似；漆黄素（5 mg/kg）与阈下剂量胡椒碱合用后可增加该三个脑区中去甲肾上腺素（NE）的含量。研究表明，海马、额叶皮层和杏仁核中单胺递质的变化与动物的情感、动机、学习和记忆行为有密切关系[22]。如今采用的传统的抗抑郁药是通过抑制神经递质再摄取或减少其降解从而增加去甲肾上腺素的含量。基于行为学和单胺递质的结果，漆黄素与胡椒碱的协同作用可能是通过脑内单胺递质（去甲肾上腺素和5-羟色胺）代谢的调节，从而来拮抗抑郁症的发生。这个与目前研究较多的5-羟色胺和去甲肾上腺素重吸收抑制剂或者选择性5-羟色胺或去甲肾上腺素重吸收抑制剂的机制相似，都是通过增加脑内的单胺类神经递质水平来改善抑郁症状。

改善抑郁症除了可以通过增加突触内的神经递质水平，也可以通过抑制单胺氧化酶来增加突触间隙中的神经递质含量。单胺氧化酶是一类可以催化降解单胺神经递质如5-羟色胺，去甲肾上腺素和多巴胺的线粒体结合同工酶[23]。根据底物的特异性和对抑制剂的敏感性单胺氧化酶可以分为MAO-A和MAO-B两类。其中单胺氧化酶-A主要是代谢脑区内与抑郁密切相关的去甲肾上腺素和5-羟色胺，单胺氧化酶-B主要是代谢多巴胺和去甲肾上腺素[24]。目前临床上抗抑郁药物基本上是通过抑制单胺氧化酶的活性（如吗氯贝胺）和增加中枢神经递质水平（如丙咪嗪）来达到抗抑郁作用的[25]。然而单胺氧化酶抑制剂比三环类抗抑郁药（丙咪嗪）的效果更好。为了证实漆黄素和胡椒碱的联合用药是否通过抑制单胺氧化酶的活性来增加中枢突触内的单胺递质水平，本实验测定了用药后脑组织的单胺氧化酶活性。结果发现，漆黄素与阈下剂量胡椒碱联合用药能够抑制单胺氧化酶-A的活性，这与各个脑区中单胺递质水平的变化一致。与单胺氧化酶A不同，漆黄素与胡椒碱的联合应用对MAO-B的活性没有太大的影响。以上对单胺氧化酶活性的作用与阳性对照药吗氯贝胺的作用结果相似。进一步说明了漆黄素与胡椒碱联合应用可能是通过抑制脑内单胺氧酶的活性来增加脑内突触中单胺递质的水平来改善抑郁样行为学。此外，新型的选择性MAO-AB抑制剂如TV-3326具有抗抑郁样作用，但是不会产生“奶酪”反应（例如，急性高血压和头痛）。说明单胺氧化酶抑制剂为治疗抑郁症提供了良好的作用效果。

在小鼠强迫游泳和小鼠悬尾实验中发现漆黄素和阈下剂量的胡椒碱联合应用具有明显的抗抑郁样作用，该作用可能与中枢单胺能神经系统有关。本研究发现漆黄素和胡椒碱的联合使用可能是通过抑制MAO-A活性来调节脑内5-羟色胺和去甲肾上腺素的递质代谢来发挥抗抑郁样作用。由此，通过联合使用胡椒碱增加漆黄素的药理效果，为减少药物的毒副作用，开发新型高效的天然抗抑郁药提供了新的思路，后续的研究将进一步从机制通路来表明其抗抑郁样作用，并寻找新的药物作用靶点。

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（收稿日期：2014-05-07）

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（收稿日期：2014-05-07）