复方中草药提取物对鲤鱼非特异性免疫及生长性能的影响

吴卫星+申亮+张秀文+齐遵利

摘要：将黄芪多糖、人参茎叶总皂苷、绿原酸、生物碱和黄酮等5种中草药提取物按照一定的比例制成复方添加剂。将其以0（对照组）、0.1%（B1）、0.2%（B2）、0.3%（B3）的比例加入到基础饲料中制成颗粒膨化饲料投喂鲤鱼，研究复方中草药提取物对鲤鱼非特异性免疫及生长性能的影响。结果表明，鲤鱼血清中的过氧化氢酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶的活性均强于对照组，但是B2组的鲤鱼又显著强于其他3组；饲养后42 d，B1组和B2组鲤鱼体质量均高于对照组。

关键词：复方中草药；鲤鱼；非特异性免疫；生长性能

中图分类号：S942.5 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0236-03

近20年来，人们逐渐发现抗生素和激素这些添加剂的应用对水产养殖业发展起一定的促进作用，但同时也带来了不可避免的负面效应。抗生素的大量使用和滥用破坏了动物体内微生态的平衡，导致耐药菌株的产生，使动物免疫力下降^[1]。因此，世界上许多国家先后作出限用或禁用抗生素作饲料添加剂的决定，特别是欧盟已法定从 2000 年开始所有成员国全面禁止使用抗生素作饲料添加剂。2006 年，因滥用抗生素引起的“多宝鱼事件”给我国大菱鲆主要养殖区（山东、河北）造成了巨大的经济损失，严重影响了大菱鲆养殖业的健康快速发展。激素类的大量使用使动物体内的非特异性免疫能力下降^[2]，所以天然的中草药添加剂引起了国内外的重视。

中草药饲料添加剂是以自然界中动物、植物等为原料加工而成的饲料添加剂，具有高效、低毒、低残留等优点^[3]。但是，传统的中草药添加剂往往是将中草药粉碎后直接添加到饲料中进行投喂的，存在药效慢、添加量大、适口性差、成本高等缺点。为了保证中草药添加剂的效果，本试验采用高浓度中草药和纯中草药提取物进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用鱼

试验鱼为天津市换新水产良种场培育的健康鲤鱼，规格约150 g/尾。鲤鱼采购后，先用5%食盐水浸泡20 min消毒，然后放入暂养池内驯化2周。暂养期间，投喂饲料为基础饲料，以鲤鱼出现有规律摄食为驯化指标。

1.1.2 试验药品

试验药品成分为黄芪多糖、人参茎叶总皂苷、绿原酸、生物碱和黄酮，均购自河北征宇制药有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验设计与管理

将各试验药品根据中草药药理及相互配伍原则配制，分别以0（对照）、0.1%（B1）、0.2%（B2）、0.3%（B3）的比例加入到基础饲料中，每组3个平行，每个平行放置25尾试验鱼，分别随机放入12个网箱内。每天08：00、12：00和16：00定时投喂，每天的投喂量约为体质量的3%，隔天09：00清池换水1/4，全天充氧，水温控制在 25 ℃ 左右。

1.2.2 生长指标的测定

喂养42 d后，每组捞取25尾鱼称重，计算各组鱼的相对增重率和成活率。每天检查草鱼的发病或死亡情况，做好记录，最后统计各组的成活率。饲料系数（CF）=饲料消耗量/增加的质量；相对增重率=（末尾平均体质量-初尾平均体质量）/初尾平均体质量×100%；成活率=试验末鱼总数/试验初鱼总数×100%。

1.2.3 生化指标的测定

1.2.3.1 血清的采集及制备

分别在试验后14、28、42 d 时，从每个试验处理组随机取2尾鱼，用盛有肝素钠的一次性注射器采血2 mL，立即轻轻摇匀，使血液抗凝，置于 4 ℃ 冰箱内保存。

1.2.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定

采用南京建成生物工程研究中心生产的SOD试剂盒测定。原理：SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，通过黄嘌呤及其氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈紫红色，用可见光分光光度计测定其吸光度；当样品中含有SOD时，则因对超氧阴离子自由基专一性的抑制作用使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度低于对照管。定义：1 mL反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为1个活性单位（U）。

1.2.3.3 溶菌酶（LSZ）活性的测定

采用南京建成生物工程研究中心生产的溶菌酶试剂盒测定。原理：在一定浓度的混浊菌液中，由于溶菌酶能水解细菌细胞壁上肽聚糖而使细菌裂解浓度降低，透光度增强，因此根据透光度变化来推测溶菌酶的活性。定义：在温度为37 ℃、波长为530 nm下，1 min内引起吸光度下降0.001为1个活性单位。

1.2.3.4 过氧化氢酶（CAT）活性的测定

采用南京建成生物工程研究中心生产的过氧化氢酶试剂盒测定。原理：CAT分解H2O2的反应可通过钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，通过测定其生成量可计算出CAT的活性。定义：1 mL血清或血浆1 s分解1 μmol的H2O2的量为1个活力单位（U）。

1.2.3.5 酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）活性的测定

采用南京建成生物工程研究中心生产的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶试剂盒测定。原理：酸性磷酸酶或者碱性磷酸酶在分解产生磷酸苯二钠的同时产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定ACP、AKP的活性。ACP活性单位的定义：100 mL血清在37 ℃与基质作用30 min时产生1 mg酚为1个金式单位。AKP活性单位的定义：100 mL血清在37 ℃与基质作用15 min时产生1 mg酚为1个金氏单位。

1.2.3.6 谷草转氨酶（GOT）活性的测定endprint

采用南京建成生物工程研究中心生产的GOT试剂盒测定。GOT能使α-酮戊二酸和天门冬氨酸转移置换氨基和丙酮，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反应过程中自行脱羧成丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用产生2，4-二硝基苯腙，在碱性环境中显棕色，比色后可得出其活性。定义：1 mL血清，反应液总容量3 mL，340 nm波长，1 cm光径，25 ℃，1 min内所生成的丙酮酸，将NaOH氧化成Na+而引起吸光度每下降0.001为1个卡门氏单位。

1.3 数据处理

用SPSS 19.0进行数据处理，采用一般线性模型进行比较以及单因素方差分析，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 复方中草药添加剂对鲤鱼生长性能的影响

由表1可知，6周后添加复方中草药的饲料能使鲤鱼的生长性能有所增强。但是，B1组的增重效果与B3组差异不显著；B2组的增重率显著高于其他3组（P<0.05），但其饲料系数显著低于其他3组（P<0.05）。

3 结论与讨论

3.1 复方中草药添加剂对鲤鱼生长性能的影响

本试验是按照医学配伍的原则将黄芪多糖、人参茎叶总皂苷、绿原酸、生物碱和黄酮等5种中草药提取物按照一定比例配制的。结果表明，复方中草药添加剂能够提高试验组鲤鱼增重率，降低饲料系数，其中B2组效果较明显，这一结果和许多学者的试验结果一致。例如，齐遵利等发现，在饲料中添加黄芪、黄芩、大黄、大蒜能促进草鱼的生长，降低饲料系数^[4]；阮国良等发现，五加皮、黄芪、茯苓及这3 种中药的混合物均对黄鳝的增重有显著的促进作用，且五加皮对黄鳝的增重最明显^[5]；童圣英等发现，山奈（沙姜、山辣）中含有大量的有机酸，对皱纹盘鲍具有明显的诱食作用^[6]；曾虹等在鲤鱼饵料中添加11 mg/kg大蒜素，结果发现其可显著提高鲤鱼成活率2.6%、增重率14.3%，同时还能提高饲料转化率11%^[7]。

3.2 复方中草药添加剂对鲤鱼非特异性免疫的影响

本试验发现，在基础饲料中添加不同剂量的复方中草药提取物能提高草鱼的免疫力和抗病力，表现为血清中CAT、LSZ、SOD活性均显著高于对照组。各组的辅助免疫指标ACP、AKP、GOT活性差异不大，说明试验采样的动物基本生理指标差异不大，没有在得病时被随机取样。蔡中华等用中药大黄、黄连、花粉、无花果4种中草药喂养鲤鱼，结果发现，鱼体免疫器官质量增加，溶菌物质的溶菌活性及吞噬能力增强，鱼体特异性免疫能力显著提高^[8]。崔青曼等用海藻多糖、大黄、黄芪、连翘等喂养河蟹，通过检测河蟹的血细胞吞噬活性、血清凝集效价及血清杀菌活性等免疫学指标后证实，该添加剂可显著提高河蟹机体的免疫功能^[9]。Sun等研究了黄芪多糖对仿刺参免疫的影响，结果发现，黄芪多糖能促进仿刺参体腔细胞的吞噬能力^[10]。Ying等确认了黄芪和灵芝能提高鲤鱼白细胞吞噬活性和血清溶菌活性^[11]。李超等将黄芪、大蒜、菊花、山楂和板蓝根5味中草药等比的水提取物分别按质量分数1%、2%、4%、8%的比例添加到基础饲料中饲喂草鱼，结果显示，各组草鱼的LSZ、SOD活性均极显著增强了^[12]。

综合复方中草药添加剂对鲤鱼生长性能和非特异性免疫指标的综合比较得出，B2组鲤鱼生长和非特异免疫性能均显著强于其他3组。因此，在基础饲料中添加0.2%复方中草药添加剂效果最佳。

参考文献：

[1]邱楚武. 抗菌素的合理选用[J]. 中国饲料，1998（4）：42-44.

[2]赵振山，高贵琴. 鱼类必需脂肪酸营养研究进展[J]. 饲料研究，1996（12）：12-15.

[3]谢仲权，牛树琦.天然植物饲料添加剂生产技术与质量标准[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2004：23-28.

[4]齐遵利，张秀文，孙步太，等. 复方中草药饲料添加剂对草鱼生长性能和免疫保护力的影响[J]. 科学养鱼，2009（12）：64-66.

[5]阮国良，杨代勤，王金龙.几种中草药饲料添加剂对黄鳝免疫功能和生长性能的影响[J]. 饲料工业，2005，26（24）：34-36.

[6]童圣英，赵 艳，李 宏，等. 几种常用中草药对皱纹盘鲍摄食行为的影响[J]. 大连水产学院学报，1998，12（4）：73-76.

[7]曾 虹，任泽林，郭 庆.大蒜素在罗非鱼饲料中的应用[J]. 中国饲料，1996（21）：29-30.

[8]蔡中华，陈成勋，邢克智，等. 四种中药对鲤鱼非特异性免疫功能的影响[J]. 天津农学院学报，1998，5（2）：31-34.

[9]崔青曼，张耀红，袁春营.中草药、多糖复方添加剂提高河蟹机体免疫力的研究[J]. 水利渔业，2001，21（4）：40-41.

[10]Sun Y X，Jin L J，Wang T T，et al. Polysaccharides from Astragalus membranaceus promote phagocytosis and superoxide anion（O2） production by coelomocytes from sea cucumber Apostichopus japonicus in vitro[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Toxicology & Pharmacology，2008，147（3）：293-298.

[11]Ying J，Aardo L，Thompson K D，et al. Chinese herbs （Astragalus radix and Ganoderma lucidum） enhance immuneresponse of carp，Cyprinus carpio，and protection against Aeromonas hydrophila[J]. Fish and Shellfish Immunology，2009，26（1）：140-145.

[12]李 超，张其中，杨莹莹，等. 不同剂量复方中草药免疫增强剂对草鱼生长性能和免疫功能的影响[J]. 上海海洋大学学报，2011，20（4）：534-540.endprint

采用南京建成生物工程研究中心生产的GOT试剂盒测定。GOT能使α-酮戊二酸和天门冬氨酸转移置换氨基和丙酮，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反应过程中自行脱羧成丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用产生2，4-二硝基苯腙，在碱性环境中显棕色，比色后可得出其活性。定义：1 mL血清，反应液总容量3 mL，340 nm波长，1 cm光径，25 ℃，1 min内所生成的丙酮酸，将NaOH氧化成Na+而引起吸光度每下降0.001为1个卡门氏单位。

1.3 数据处理

用SPSS 19.0进行数据处理，采用一般线性模型进行比较以及单因素方差分析，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 复方中草药添加剂对鲤鱼生长性能的影响

由表1可知，6周后添加复方中草药的饲料能使鲤鱼的生长性能有所增强。但是，B1组的增重效果与B3组差异不显著；B2组的增重率显著高于其他3组（P<0.05），但其饲料系数显著低于其他3组（P<0.05）。

3 结论与讨论

3.1 复方中草药添加剂对鲤鱼生长性能的影响

本试验是按照医学配伍的原则将黄芪多糖、人参茎叶总皂苷、绿原酸、生物碱和黄酮等5种中草药提取物按照一定比例配制的。结果表明，复方中草药添加剂能够提高试验组鲤鱼增重率，降低饲料系数，其中B2组效果较明显，这一结果和许多学者的试验结果一致。例如，齐遵利等发现，在饲料中添加黄芪、黄芩、大黄、大蒜能促进草鱼的生长，降低饲料系数^[4]；阮国良等发现，五加皮、黄芪、茯苓及这3 种中药的混合物均对黄鳝的增重有显著的促进作用，且五加皮对黄鳝的增重最明显^[5]；童圣英等发现，山奈（沙姜、山辣）中含有大量的有机酸，对皱纹盘鲍具有明显的诱食作用^[6]；曾虹等在鲤鱼饵料中添加11 mg/kg大蒜素，结果发现其可显著提高鲤鱼成活率2.6%、增重率14.3%，同时还能提高饲料转化率11%^[7]。

3.2 复方中草药添加剂对鲤鱼非特异性免疫的影响

本试验发现，在基础饲料中添加不同剂量的复方中草药提取物能提高草鱼的免疫力和抗病力，表现为血清中CAT、LSZ、SOD活性均显著高于对照组。各组的辅助免疫指标ACP、AKP、GOT活性差异不大，说明试验采样的动物基本生理指标差异不大，没有在得病时被随机取样。蔡中华等用中药大黄、黄连、花粉、无花果4种中草药喂养鲤鱼，结果发现，鱼体免疫器官质量增加，溶菌物质的溶菌活性及吞噬能力增强，鱼体特异性免疫能力显著提高^[8]。崔青曼等用海藻多糖、大黄、黄芪、连翘等喂养河蟹，通过检测河蟹的血细胞吞噬活性、血清凝集效价及血清杀菌活性等免疫学指标后证实，该添加剂可显著提高河蟹机体的免疫功能^[9]。Sun等研究了黄芪多糖对仿刺参免疫的影响，结果发现，黄芪多糖能促进仿刺参体腔细胞的吞噬能力^[10]。Ying等确认了黄芪和灵芝能提高鲤鱼白细胞吞噬活性和血清溶菌活性^[11]。李超等将黄芪、大蒜、菊花、山楂和板蓝根5味中草药等比的水提取物分别按质量分数1%、2%、4%、8%的比例添加到基础饲料中饲喂草鱼，结果显示，各组草鱼的LSZ、SOD活性均极显著增强了^[12]。

综合复方中草药添加剂对鲤鱼生长性能和非特异性免疫指标的综合比较得出，B2组鲤鱼生长和非特异免疫性能均显著强于其他3组。因此，在基础饲料中添加0.2%复方中草药添加剂效果最佳。

参考文献：

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[10]Sun Y X，Jin L J，Wang T T，et al. Polysaccharides from Astragalus membranaceus promote phagocytosis and superoxide anion（O2） production by coelomocytes from sea cucumber Apostichopus japonicus in vitro[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Toxicology & Pharmacology，2008，147（3）：293-298.

[11]Ying J，Aardo L，Thompson K D，et al. Chinese herbs （Astragalus radix and Ganoderma lucidum） enhance immuneresponse of carp，Cyprinus carpio，and protection against Aeromonas hydrophila[J]. Fish and Shellfish Immunology，2009，26（1）：140-145.

[12]李 超，张其中，杨莹莹，等. 不同剂量复方中草药免疫增强剂对草鱼生长性能和免疫功能的影响[J]. 上海海洋大学学报，2011，20（4）：534-540.endprint

采用南京建成生物工程研究中心生产的GOT试剂盒测定。GOT能使α-酮戊二酸和天门冬氨酸转移置换氨基和丙酮，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反应过程中自行脱羧成丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用产生2，4-二硝基苯腙，在碱性环境中显棕色，比色后可得出其活性。定义：1 mL血清，反应液总容量3 mL，340 nm波长，1 cm光径，25 ℃，1 min内所生成的丙酮酸，将NaOH氧化成Na+而引起吸光度每下降0.001为1个卡门氏单位。

1.3 数据处理

用SPSS 19.0进行数据处理，采用一般线性模型进行比较以及单因素方差分析，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 复方中草药添加剂对鲤鱼生长性能的影响

由表1可知，6周后添加复方中草药的饲料能使鲤鱼的生长性能有所增强。但是，B1组的增重效果与B3组差异不显著；B2组的增重率显著高于其他3组（P<0.05），但其饲料系数显著低于其他3组（P<0.05）。

3 结论与讨论

3.1 复方中草药添加剂对鲤鱼生长性能的影响

本试验是按照医学配伍的原则将黄芪多糖、人参茎叶总皂苷、绿原酸、生物碱和黄酮等5种中草药提取物按照一定比例配制的。结果表明，复方中草药添加剂能够提高试验组鲤鱼增重率，降低饲料系数，其中B2组效果较明显，这一结果和许多学者的试验结果一致。例如，齐遵利等发现，在饲料中添加黄芪、黄芩、大黄、大蒜能促进草鱼的生长，降低饲料系数^[4]；阮国良等发现，五加皮、黄芪、茯苓及这3 种中药的混合物均对黄鳝的增重有显著的促进作用，且五加皮对黄鳝的增重最明显^[5]；童圣英等发现，山奈（沙姜、山辣）中含有大量的有机酸，对皱纹盘鲍具有明显的诱食作用^[6]；曾虹等在鲤鱼饵料中添加11 mg/kg大蒜素，结果发现其可显著提高鲤鱼成活率2.6%、增重率14.3%，同时还能提高饲料转化率11%^[7]。

3.2 复方中草药添加剂对鲤鱼非特异性免疫的影响

本试验发现，在基础饲料中添加不同剂量的复方中草药提取物能提高草鱼的免疫力和抗病力，表现为血清中CAT、LSZ、SOD活性均显著高于对照组。各组的辅助免疫指标ACP、AKP、GOT活性差异不大，说明试验采样的动物基本生理指标差异不大，没有在得病时被随机取样。蔡中华等用中药大黄、黄连、花粉、无花果4种中草药喂养鲤鱼，结果发现，鱼体免疫器官质量增加，溶菌物质的溶菌活性及吞噬能力增强，鱼体特异性免疫能力显著提高^[8]。崔青曼等用海藻多糖、大黄、黄芪、连翘等喂养河蟹，通过检测河蟹的血细胞吞噬活性、血清凝集效价及血清杀菌活性等免疫学指标后证实，该添加剂可显著提高河蟹机体的免疫功能^[9]。Sun等研究了黄芪多糖对仿刺参免疫的影响，结果发现，黄芪多糖能促进仿刺参体腔细胞的吞噬能力^[10]。Ying等确认了黄芪和灵芝能提高鲤鱼白细胞吞噬活性和血清溶菌活性^[11]。李超等将黄芪、大蒜、菊花、山楂和板蓝根5味中草药等比的水提取物分别按质量分数1%、2%、4%、8%的比例添加到基础饲料中饲喂草鱼，结果显示，各组草鱼的LSZ、SOD活性均极显著增强了^[12]。

综合复方中草药添加剂对鲤鱼生长性能和非特异性免疫指标的综合比较得出，B2组鲤鱼生长和非特异免疫性能均显著强于其他3组。因此，在基础饲料中添加0.2%复方中草药添加剂效果最佳。

参考文献：

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[6]童圣英，赵 艳，李 宏，等. 几种常用中草药对皱纹盘鲍摄食行为的影响[J]. 大连水产学院学报，1998，12（4）：73-76.

[7]曾 虹，任泽林，郭 庆.大蒜素在罗非鱼饲料中的应用[J]. 中国饲料，1996（21）：29-30.

[8]蔡中华，陈成勋，邢克智，等. 四种中药对鲤鱼非特异性免疫功能的影响[J]. 天津农学院学报，1998，5（2）：31-34.

[9]崔青曼，张耀红，袁春营.中草药、多糖复方添加剂提高河蟹机体免疫力的研究[J]. 水利渔业，2001，21（4）：40-41.

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[11]Ying J，Aardo L，Thompson K D，et al. Chinese herbs （Astragalus radix and Ganoderma lucidum） enhance immuneresponse of carp，Cyprinus carpio，and protection against Aeromonas hydrophila[J]. Fish and Shellfish Immunology，2009，26（1）：140-145.

[12]李 超，张其中，杨莹莹，等. 不同剂量复方中草药免疫增强剂对草鱼生长性能和免疫功能的影响[J]. 上海海洋大学学报，2011，20（4）：534-540.endprint