泽泻醇提物及其萜类成分对拟南芥幼苗生长抑制作用的研究

付绍智+杨晓燕+燕志强+金辉+张等宏+秦波

摘要：以模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）为受体，采用活体生物试验方法测定泽泻[Alisma orientalis（Sam.）Juzep.]醇提物及其主要萜类活性成分对7日龄拟南芥幼苗生长的影响。结果表明，泽泻醇提物对拟南芥幼苗的生长有较强的抑制作用，23-乙酰泽泻醇B对拟南芥幼苗的生长表现出抑制作用，呈现较好的量效关系。而泽泻醇A醋酸酯对拟南芥幼苗的生长无明显影响。研究证明泽泻醇提物对拟南芥幼苗的生长有显著的抑制作用，其中23-乙酰泽泻醇B是泽泻潜在的化感活性成分。

关键词：泽泻[Alisma orientalis（Sam.）Juzep.]；萜类化合物；拟南芥（Arabidopsis thaliana）；23-乙酰泽泻醇B

中图分类号：Q148.12 文章标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）15-3556-04

Inhibitory Effects of the Ethanol Extract and Two Triterpenoids from Alisma orientalis on the Growth of Arabidopsis thaliana Seedling

FU Shao-zhi1， YANG Xiao-yan2， YAN Zhi-qiang2，JIN Hui2， ZHANG Deng-hong2， QIN Bo2

（1. Chongqing Three Gorges Medical College of traditional Chinese Medicine Research Institute， Chongqing 404120，China ；2. Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources/Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province， Lanzhou Institute of Chemical Physics， Chinese Academy of Sciences， Lanzhou 730000，China）

Abstract： The inhibitory effects of the ethanol extract and two triterpenoids from Alisma orientalis on the 7-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana were studied and compared with bioassay methods.The results showed that the ethanol extract had significant inhibitory activity on the growth of Arabidopsis thaliana seedling 23-O-Acetylalisol B significantly reduced the fresh weight and root length of Arabidopsis thaliana seedlings， with a dose-dependent phytotoxic effect. Alisol A 24-acetate had no effect on the growth of Arabidopsis thaliana seedlings. The extract had a significant inhibitory effect on Alisma orientalis. 23-O-Acetylalisol B might be a potential allelopathic active substance of Alisma orientalis.

Key words：Alisma orientalis（Sam.） Juzep.； Triterpenoids； Arabidopsis thaliana； 23-O-Acetylalisl B

收稿日期：2014-01-10

基金项目：国家自然基金项目（31070386；21102154）；重庆市科技攻关项目（CSTC2011AC5140）

作者简介：付绍智（1965-），男，重庆云阳人，副教授，硕士，主要从事药用植物资源与生态学的研究，（电话）13896380613（电子信箱）fushaozhi@sina.com；

秦 波（1966-），男，甘肃镇原人，研究员，博士，主要从事植物化学生态学的研究，（电话）0931-4968372（电子信箱）bqin@licp.cas.cn。

泽泻[Alisma orientalis（Sam.）Juzep.]为泽泻科多年沼生草本植物，其干燥块茎作为传统常用中药，具有利水渗湿的功效，主产于福建（建泽泻）和四川（川泽泻）等地，丛生于浅水或沼泽边缘[1，2]。泽泻含有多种萜类化合物，具有抗血栓、降血脂、利尿、抗脂肪肝、抗肾炎、促进免疫调节等多种药理作用[3，4]。研究水生植物的毒活性物质、化感作用对水质净化、水环境治理及生态文明建设具有重要意义[5，6]。迄今为止，对于长期生长在温湿水环境下的泽泻的化感作用和植物毒活性物质尚未见研究报道[7，8]。本研究以拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗为活性试验受体，对泽泻醇提物和泽泻体内主要活性成分23-乙酰泽泻醇B及泽泻醇A醋酸酯的植物毒活性作用进行研究，以期为泽泻植物毒活性物质的发现及其资源的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 泽泻醇提物制备 泽泻采自重庆市梁平县城北乡两路村，地下块茎40 ℃低温烘干，称取100 g块茎组织粉碎后用75%乙醇提取，提取液减压浓缩，获得泽泻浓缩浸膏低温保存待用。

1.1.2 受体植物 拟南芥Col野生型种子由兰州大学生命科学院刘恒副教授实验室提供。

1.1.3 泽泻萜类成分 23-乙酰泽泻醇B（CAS NO：26575-95-1）购自成都曼思特生物科技有限公司，泽泻醇A醋酸酯（CAS NO：18674-16-3）购自上海永恒生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥培养 将拟南芥种子置于4 ℃冰箱避光放置3 d，70%乙醇表面消毒30 s，去离子水清洗3次，0.1%氯化汞表面消毒7 min，去离子水清洗6次，播于1/2 MS固体培养基上（直径为9 cm的培养皿），置于光照培养箱中培养，培养光照强度为2 000 lx，光周期（L；D）为光16 h∶暗8 h，培养温度22 ℃。

1.2.2 泽泻醇提物对拟南芥幼苗生长影响的测定 称取泽泻醇提物141.2 mg，加入甲醇溶解，配制成浓度为80 mg/mL的母液1.765 mL，经无菌滤膜过滤，用去离子水配制成4个浓度梯度（5、10、20、40 mg/mL）的处理溶液。在24孔板中每孔加入1/2 MS液体培养基990 μL及上述4个浓度的试验样品溶液各10 μL，于超净工作台中接种7日龄拟南芥幼苗，使试验组的终浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/mL。置于恒温光照摇床中培养7 d后，用滤纸吸去水分，称量拟南芥幼苗鲜重，并测量其根长。每处理各设3个重复，以同样比例的甲醇作对照（0 mg/mL浓度组），甲醇的用量不超过总体积的1%，恒温摇床的培养温度22 ℃，转速105 r/min.，光照周期（L∶D）为16 h∶8 h。

1.2.3 23-乙酰泽泻醇B和泽泻醇A醋酸酯对拟南芥幼苗生长影响的测定 分别称取23-乙酰泽泻醇B标准品2.00 mg和泻醇A醋酸酯标准品2.02 mg，加入100 μL甲醇溶解，分别配制成浓度为20 mg/mL的母液，经无菌滤膜过滤，用去离子水配成4个浓度梯度（试验组终浓度为0.025、0.050、0.100、0.200 mg/mL）的处理溶液。其他试验方法同1.2.2。

1.3 试验数据统计分析

测量数据采用Excel 2003进行数据处理，SPSS 16.0统计软件进行显著性分析。

相对鲜重=处理组幼苗鲜重/对照组幼苗根长×100%

相对根长=处理组幼苗根长/对照组幼苗根长×100%

2 结果与分析

2.1 泽泻醇提物对拟南芥幼苗鲜重的影响

用不同浓度的泽泻醇提物处理7日龄拟南芥幼苗，对拟南芥幼苗鲜重抑制作用及其显著性分析结果见图1。由图1可见，与泽泻醇提物对拟南芥幼苗的生长有较强的抑制作用，呈现较好的量效关系。与对照相比，0.05、0.10、0.20 mg/mL泽泻醇提物处理组对拟南芥幼苗生长的抑制作用达显著水平（P<0.05），经0.40 mg/mL泽泻醇提物处理组差异达极显著水平（P<0.01）。0.40 mg/mL泽泻醇提物处理后拟南芥幼苗鲜重仅为对照的45.03%。

2.2 泽泻醇提物对拟南芥幼苗根长的影响

泽泻醇提物在不同浓度条件下，对拟南芥幼苗根长的影响测定结果如图2所示。由图2可见，泽泻醇提物对拟南芥幼苗根长有较强的抑制作用，呈现良好的量效关系。与对照组相比，0.10、0.20 mg/mL处理组对拟南芥幼苗根长的抑制达显著水平（P<0.05）， 0.40 mg/mL泽泻醇提物处理组差异达极显著水平（P<0.01）。0.40 mg/mL泽泻醇提物处理后拟南芥幼苗根长仅为对照的38.06%。

2.3 萜类化合物23-乙酰泽泻醇B和泽泻醇A醋酸酯对拟南芥幼苗鲜重的影响

在不同浓度条件下，23-乙酰泽泻醇B和泽泻醇A醋酸酯对拟南芥幼苗鲜重的影响测定结果如图3所示。由图3可见，23-乙酰泽泻醇B对拟南芥幼苗鲜重有较强的抑制作用，呈现良好的量效关系，0.100 mg/mL 23-乙酰泽泻醇B处理后拟南芥幼苗鲜重仅为对照的51.17%。同等浓度下，泽泻醇A醋酸酯对拟南芥幼苗鲜重无明显影响。

2.4 萜类化合物23-乙酰泽泻醇B和泽泻醇A醋酸酯对拟南芥幼苗根长的影响

23-乙酰泽泻醇B和泽泻醇A醋酸酯对拟南芥幼苗根长的影响测定结果如图4至图6所示，由图4、图5可见，23-乙酰泽泻醇B对拟南芥幼苗根长在0.050 mg/mL浓度时开始表现出抑制效果，随着浓度的增大其抑制作用越来越强，0.200 mg/mL浓度处理后拟南芥幼苗根长仅为对照的37.10%。泽泻醇A醋酸酯在0.200 mg/mL浓度时对拟南芥幼苗根长表现出一定的抑制作用（图4、图6），但与对照相比无显著差异。

3 小结与讨论

泽泻次生代谢物的主要成分为萜类物质[9]。萜类是天然物质中种类最多的一类，也是一类重要的化感物质[10]。萜类化感物质合成后大多通过植物体挥发或根系分泌等途径进入土壤，从而影响自身及邻近植物的生长[11-17]。通过对两种泽泻萜类活性物质23-乙酰泽泻醇B及泽泻醇A醋酸酯进行研究，结果表明，23-乙酰泽泻醇B能够显著抑制拟南芥幼苗的生长，而泽泻醇A醋酸酯对拟南芥幼苗生长没有明显抑制作用，这可能与两种萜类活性物质的化学结构及所含活性基团不同有关[17]。23-乙酰泽泻醇B对拟南芥幼苗生长的影响表现出较特殊的作用效果，当浓度为0.200 mg/mL时，其对拟南芥幼苗的鲜重和根长的抑制作用较浓度为0.100 mg/mL时有所减弱，而泽泻醇提物也表现出相似的作用效果。结果表明，23-乙酰泽泻醇B是泽泻醇提物的重要有效成分，可作为新型植物源农药开发的活性先导物质，同时也可作为潜在的化感物质，对泽泻生长的周围环境中其他植物的生长发育产生抑制作用。

近年来，水环境的污染治理成为备受社会关注的问题之一。目前，通过水生植物治理水体污染从而净化水质是研究的热点领域。水生植物在水体中重要的生态功能使其在水环境治理中具有很大的应用价值[18]。水生植物通过其植物毒活性物质及化感作用对水环境中的污染源如水华藻类等产生抑制作用，从而达到治理水体污染的目的[19]。本研究选取浅水水生植物泽泻为供体，用泽泻醇提物对拟南芥幼苗进行生长抑制试验。研究结果表明泽泻醇提物对拟南芥幼苗的鲜重和根长都有明显的抑制作用。在浓度为0.40 mg/mL时，拟南芥幼苗鲜重仅为对照的45.03%，根长仅为对照的38.06%，可见泽泻具有良好的化感作用潜力。同时，通过对泽泻中两种重要萜类化合物活性作用的研究发现，23-乙酰泽泻醇B能够显著抑制拟南芥幼苗生长，在浓度为0.100 mg/mL时，拟南芥幼苗鲜重仅为对照的51.17%，根长仅为对照的37.10%，可见23-乙酰泽泻醇B是泽泻的重要有效活性成分，可作为潜在的化感物质发挥作用。因此，进一步深入地开展泽泻化感作用的研究，在由水体富营养化等因素造成的藻类污染治理方面具有重要意义[20]。

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