温度和盐度对褐牙鲆幼鱼渗透生理及抗氧化水平的影响

郭勤单 王有基 吕为群

(上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306)

褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)俗称比目鱼、高眼、平目、左口、偏口鱼、牙片等, 属硬骨鱼纲(Osteichthys)、鲽形目(Pleuronectiformes)、鲆科(Bothidae)、牙鲆属(Paralichthys), 主要分布于朝鲜半岛、日本、俄国远东沿岸海区和我国的黄渤海、东海及南海。近年来, 随着海水养殖热潮的掀起, 褐牙鲆作为名贵的暖温广盐性底栖鱼类, 已成为我国重要的海水增养殖鱼类之一。

盐度和温度是水产动物生活环境中两个重要的理化因子, 水体环境的变化会导致鱼体产生不同程度的应激反应, 引发机体一系列生理变化进而影响内环境的稳定[1,2]。温度变化可以影响鱼类新陈代谢等生理活动, 盐度通过渗透压调节影响机体的各项生理机能[3,4]。此外, 许多研究表明水温[5]、盐度[6]等环境条件的改变影响机体氧自由基的平衡, 造成氧化压力, 当机体抗氧化系统不足以清除体内过多自由基时, 就会对机体产生氧化损伤。关于盐度和温度对牙鲆生理影响的研究已有一些报道, 潘鲁青等研究表明褐牙鲆幼鱼在渗透适应的过程中, 在盐度突变 3d内基本上是其被动地对外界环境适应阶段, 在 6d时, 血浆渗透压处于稳定状态[7]; 徐冬冬等研究了高温胁迫对褐牙鲆幼鱼生长及抗氧化酶活性的影响[8]。而盐度和温度双因素对褐牙鲆渗透生理和抗氧化水平影响的研究尚无报道。在自然环境中, 褐牙鲆常出现从近岸迁徙到河口水域的现象,此区域常常遭受低盐(半咸水)状况, 水体环境发生较大的变化[9—11]。王智祖等观测得到6—9月份黄、东海沿岸海表温度变化范围大致在18—30℃[12]。据此,本文设置 20℃、24℃和 28℃三个温度以及半咸水10‰和正常海水 30‰两个盐度环境条件, 通过测定环境条件变化后1d和6d牙鲆幼鱼血浆皮质醇、渗透压、鳃Na+-K+-ATP酶活性以及肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和脂质过氧化物(LPO)和丙二醛(MDA)含量的变化情况, 探讨盐度和温度双因素对牙鲆幼鱼渗透生理状况和抗氧化水平的影响, 为深入研究环境变化引起的机体应激反应提供理论依据, 为室内牙鲆养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验鱼的选择和暂养

实验鱼来自中国水产科学研究院北戴河中心实验站, 挑选健康无病, 体质量为(17.17±4.93) g的牙鲆幼鱼进行实验。实验前将牙鲆幼鱼在水族缸(长、宽、高分别为78、45和58 cm)中暂养一周, 暂养期间水温为(20±1) ℃, 盐度为(30±0.5)‰, 连续充气保持溶氧浓度在(7±1) mg/L, 自然光照。每日 8:00和16:30按鱼体质量的3%投喂商品颗粒饲料(东丸, 广东), 30min后吸除残饵并换水 70%, 实验开始前一天停止喂食。

1.2 实验设计

采用析因实验设计, 设置2个盐度(10‰、30‰)和3个温度(20℃、24℃、28℃), 共6个实验组, 各实验组设3个平行, 每个平行 8尾鱼。实验用各盐度海水由红海盐(Red Sea, USA)与充分曝气的自来水进行配制。温度和盐度均用YSI便携式多参数水质测定仪(TAYASAF, 美国)进行校准。采用温度、盐度急性应激的方式, 将牙鲆幼鱼随机分组后直接由暂养条件转入各实验处理温度和盐度环境中, 实验期间不喂食, 连续充气以保证溶氧量维持在(7±1) mg/L。实验期间每隔4h校准调节一次温度、盐度, 维持温差在±0.5℃, 盐度误差在±1‰。实验持续6d, 期间各实验组中褐牙鲆幼鱼均无死亡情况出现。

1.3 样品采集、处理和测定

在急性应激后1d和6d进行取样, 每个实验组随机取鱼3尾, 迅速用0.5 mL注射器(肝素钠润洗后烘干)尾柄处取血, 随后在冰上取其肝脏和鳃组织,置于–80℃超低温冰箱中保存待测。抗凝血液经 4℃,4000 r/min离心15min后取上清, –80℃保存待测。测定指标为血浆渗透压和皮质醇、鳃Na+-K+-ATP酶活性以及肝脏SOD、CAT活性和LPO、MDA含量。

组织样品测定时加入9倍于其组织重量的生理盐水制备匀浆液, 于4 ℃, 4000 r/min 离心20min, 取上清液进行SOD、CAT活性和LPO、MDA含量的测定, 粗酶液置于4℃保存, 在24h内测定完毕。血浆渗透压用 VAPRO露点渗透压仪(Vapro-5520, 美国)进行测定, 渗透压用质量渗透浓度来表示, 即1 kg 溶剂中含 1 mmol溶质为一个渗透压单位(mOsm/kg)。皮质醇含量和LPO含量测定分别采用相应的酶联免疫试剂盒(Rapidbio, 美国)进行测定,测定原理为双抗夹心法。鳃Na+-K+-ATP酶活性、肝脏SOD、CAT活性和MDA含量的测定采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行检测, 具体测定方法参照说明书进行。其中, 规定每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1 μmol无机磷的量为一个 ATP酶活力单位, 即微摩尔磷/(毫克蛋白·小时) [μmol Pi/(mg prot·hour)]。SOD 活力测定按黄嘌呤氧化酶法, 活力单位定义为 1 mg 组织蛋白在1 mL反应液中 SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位(U)。CAT活力测定采用比色法, 活力单位定义为每秒钟分解1 μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位(U)。MDA含量测定采用TBA法。总蛋白的测定采用双缩脲法总蛋白测定试剂盒(迈瑞, 深圳), 在迈瑞 BS系列全自动生化分析仪上进行。

1.4 数据处理

实验数据经Excel 2003处理后, 以盐度和温度作为自变量, 用 SPSS 17.0软件进行双因素方差分析(Two-Way ANOVA), 如果出现显著交互影响作用,则固定其中一个因素的水平, 做另外一个因素的单因素方差分析(One-Way ANOVA)或t检验, 用Tukey HSD多重比较法进行组间差异显著性检验, 以P<0.05为差异显著, P<0.01为差异极显著。统计值均用平均值±标准差(Mean±SE)表示。

2 结果

2.1 温度和盐度对牙鲆幼鱼渗透生理的影响

双因素方差分析温度和盐度对牙鲆幼鱼血浆皮质醇、渗透压和鳃Na+-K+-ATP酶活性影响的结果见表1。环境变化后 1d和 6d, 温度和盐度双因素对牙鲆幼鱼皮质醇含量无交互作用(P﹥0.05), 且牙鲆幼鱼在各盐度和温度环境下皮质醇含量无显著性差异(图1A、B)。

环境变化1d和6d时, 温度和盐度对牙鲆幼鱼渗透压无显著交互作用(表 1)。环境变化 1d时, 温度和盐度对牙鲆幼鱼渗透压均存在极显著影响。随着温度的升高, 牙鲆幼鱼渗透压逐渐增大。在 28℃环境中, 牙鲆幼鱼渗透压盐度 30‰显著高于盐度10‰(P<0.05), 而在 20℃和 24℃时, 各盐度间均无显著差异(图1C)。环境变化6d时, 各温度和盐度环境中牙鲆幼鱼渗透压无显著性差异(图1D)。

环境条件变化 1d时, 温度和盐度对牙鲆幼鱼Na+-K+-ATP酶活力不存在显著交互作用, 而 6d时交互作用显著(表 1)。在各盐度条件下 1d时, 温度28℃环境中的牙鲆幼鱼 Na+-K+-ATP酶活性显著高于 20℃和 24℃; 在 3个温度环境中, 牙鲆幼鱼Na+-K+-ATP酶活性在各盐度间无显著性差异(图1E)。环境变化 6d时, 在半咸水(盐度 10‰)环境中,温度对牙鲆幼鱼 Na+-K+-ATP酶活性无显著性差异,而在正常海水环境中, 温度 24℃环境中牙鲆幼鱼Na+-K+-ATP酶活性显著低于 20℃和 28℃(图 1F)。在温度 28℃环境中, 30‰盐度实验组牙鲆幼鱼的Na+-K+-ATP酶活性显著高于10‰, 其他两个温度环境中, 盐度对其无显著性差异(图1F)。

2.2 温度和盐度对牙鲆幼鱼抗氧化水平的影响

温度和盐度对牙鲆幼鱼抗氧化酶活力的影响

表2显示了温度和盐度对牙鲆幼鱼超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性影响的双因素方差分析结果,可以看出环境变化后 1d温度和盐度两因素对牙鲆幼鱼肝脏SOD和CAT活性均存在交互影响。在10‰盐度条件下, 温度28℃和24℃实验组的牙鲆幼鱼肝脏 SOD活性显著高于温度 20℃(图 2A), 温度28℃环境中牙鲆幼鱼肝脏 CAT活性显著高于 20℃和24℃(图 2C)。在正常盐度环境中, 各温度组间肝脏SOD和CAT活性不存在显著性差异(图2A、C)。在温度 24℃和 28℃环境中, 低盐组肝脏 SOD活性显著高于正常海水盐度组(图2A), 而仅在温度28℃环境中肝脏CAT活性低盐组显著高于正常海水盐度组(图2C)。至环境变化后6d, 各实验组间牙鲆幼鱼肝脏SOD和CAT活性均无显著性差异(图2B、D)。

表1 双因素方差分析温度和盐度对牙鲆幼鱼血浆皮质醇、渗透压和鳃Na+-K+-ATP酶活性的影响Tab. 1 Summary of two-way ANOVA results on effects of temperature and salinity on serum cortisol, osmotic pressure and Na+-K+-ATPase activity

表2 双因素方差分析温度和盐度对牙鲆幼鱼超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的影响Tab. 2 Summary of two-way ANOVA results on effects of temperature and salinity on SOD and CAT activity

图1 温度和盐度对牙鲆幼鱼血浆皮质醇含量、渗透压和鳃Na+-K+-ATP酶活性的影响Fig. 1 Effects of salinity and temperature on serum cortisol, osmotic pressure and Na+-K+-ATPase activity of juvenile P. olivaceus

温度和盐度对牙鲆幼鱼脂质过氧化水平的影响温度和盐度双因素对牙鲆幼鱼肝脏脂质过氧化物(LPO)和丙二醛(MDA)含量影响的方差分析结果见表 3, 可以看出环境变化 1d时, 温度和盐度对牙鲆幼鱼肝脏 LPO含量不存在交互影响, 环境变化 6d时, 两因素之间存在交互作用, 而温度和盐度对牙鲆幼鱼肝脏 MDA含量交互作用的情况与 SOD和CAT一致。环境变化1d时, 低盐组(10‰)牙鲆幼鱼肝脏 LPO含量高于正常海水盐度组(30‰), 同盐度下, 温度对其不存在显著性差异(图 3A)。此时, 牙鲆幼鱼在不同环境条件肝脏 MDA含量差异很大。在低盐条件下, 温度 28℃中牙鲆幼鱼肝脏 MDA的含量显著高于其他两个温度组, 而在正常海水环境中温度对其影响不大; 在温度 28℃条件下, 低盐组褐牙鲆幼鱼肝脏 MDA含量显著高于正常海水盐度组(图3C)。环境变化6d时, 在低盐环境中温度28℃实验组牙鲆幼鱼LPO含量显著低于其他两个温度组,而在正常海水盐度环境中各温度实验组间显著不差异; 在温度20℃和24℃环境中, 低盐组肝脏LPO含量显著高于正常海水盐度组, 而在 28℃环境中则与此相反(图3B)。这时, 各实验组牙鲆幼鱼肝脏MDA含量不存在显著性差异(图3D)。

图2 温度和盐度对牙鲆幼鱼肝脏超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的影响Fig. 2 Effects of salinity and temperature on SOD and CAT activity of juvenile P. olivaceus

图3 温度和盐度对牙鲆幼鱼肝脏脂质过氧化物含量和丙二醛含量的影响Fig. 3 Effects of salinity and temperature on LPO and MDA content of juvenile P. olivaceus

表3 双因素方差分析温度和盐度对牙鲆幼鱼肝脏脂质过氧化物和丙二醛含量的影响Tab. 3 Summary of two-way ANOVA results on effects of temperature and salinity on LPO and MDA content

3 讨论

3.1 温度和盐度对牙鲆幼鱼渗透生理的影响

温度和盐度是海水鱼类生活环境中重要的环境因子, 它们的变动对鱼类的生理状况具有显著影响。当鱼类受到外界环境条件变化时, 下丘脑–垂体–肾间组织轴(HPI)被激活, 促进促肾上腺皮质激素(ACTH)的释放, 从而引起皮质醇激素的合成与释放[13]。许多研究表明皮质醇在维持机体渗透压平衡方面发挥重要作用, 如皮质醇能增强鱼体对水和离子的吸收, 刺激鳃泌氯细胞的增生、分化及Na+-K+-ATP酶活性[14,15]。吉富罗非鱼从25℃环境中急性转入 9℃后血清皮质醇激素的含量显著升高[16]。Tsui, et al.研究结果表明石斑鱼(Epinephelus malabaricus)在急性盐度应激后10—20min即达到最大值,30min之后即恢复至正常水平[17]。Bolasina, et al.研究结果表明牙鲆直接转移至低盐环境(盐度 10‰)6h时, 低盐组牙鲆皮质醇含量显著高于正常海水盐度组,之后两盐度组无显著性差异[8]。本实验结果表明温度和盐度变化后1d和6d对牙鲆幼鱼血浆皮质醇含量均无显著影响, 这说明牙鲆能够耐受温度20—28℃和低至盐度10‰的环境条件, 鱼体可以迅速调整其渗透压调节机制以适应周围环境的变化。

鱼类作为低等的脊椎动物, 其血液渗透压随外界环境的变化存在较大的波动, 并随时空的推移呈现特定的调节规律。许多研究表明鱼类对环境盐度适应过程表现为盐度变化初期可引起机体血浆渗透压发生改变, 随即刺激机体调整渗透压调节生理机制使渗透压逐渐向变化前状态恢复[18—20]。在本实验中褐牙鲆幼鱼对环境温度和盐度变化后的渗透适应过程较为明显, 1d时牙鲆幼鱼基本上处于渗透压调整阶段, 6d时各处理组褐牙鲆幼鱼血浆渗透压间无显著性差异, 牙鲆幼鱼基本处于稳定阶段。不同种类的鱼在不同温度环境中盐度对血浆渗透压的影响不同。半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)在18—24℃环境中, 鱼体血浆渗透压盐度 30显著高于盐度 22,但在温度27℃时, 各盐度组渗透压无显著性差异[21]。Sardella, et al.报道, 在35℃环境中, 将杂交罗非鱼(O. reochromis mossambicus×O. urolepis hornorum)从盐度35中转移至盐度 43—60时, 其血浆渗透压随盐度的升高呈直线上升, 而在 25℃条件下进行相应操作其血浆渗透压却无显著变化[22]。本实验结果表明仅在温度 28℃环境中, 10‰盐度组褐牙鲆幼鱼血浆渗透压显著低于正常盐度组, 在各盐度下, 褐牙鲆幼鱼血浆渗透压随温度的升高而增高。此外,本实验还显示褐牙鲆幼鱼血浆渗透压为 330—430 mOsm/kg, 与潘鲁青报道的褐牙鲆幼鱼等渗压为425.8 mOsm/kg存在一定偏差, 这可能与牙鲆幼鱼规格和生活环境不同而异。

鳃 Na+-K+-ATP酶活性的变化是广盐性鱼类参与渗透调节的重要监测指标之一, 水环境因子如温度、盐度、pH、重金属等均影响水产动物鳃Na+-K+-ATP酶活性[23]。本实验结果表明环境变化后1d温度28℃能显著提高褐牙鲆幼鱼Na+-K+-ATP酶活性, 此时褐牙鲆幼鱼体内离子运输、渗透压调节和新陈代谢都保持在较高的水平, 较多的能量用于渗透压调节, 因而鳃中Na+-K+-ATP酶活性较高, 与大菱鲆(Scophthalmus maximus)的研究结果相似[24]。随着时间的延长, 至环境变化后6d在盐度30环境中褐牙鲆幼鱼 24℃组鳃 Na+-K+-ATP酶活性显著低于20℃和28℃组, 这可能是由于在不同环境中牙鲆所处的渗透生理状态和鱼体的渗透压调节方式不同所致。盐度对鱼类Na+-K+-ATP酶活性影响的研究很多, 适应海水的漠斑牙鲆转移到淡水中 4d, 鳃Na+-K+-ATP酶活性会降低[25], 而盐度对黑鲷(Myliomacrocep halus)鳃Na+-K+-ATP酶活性几乎没有影响[26]。本实验结果表明在环境变化后1d盐度对褐牙鲆幼鱼 Na+-K+-ATP酶活性没有显著影响, 在6d时仅在 28℃环境中褐牙鲆幼鱼在盐度 10中Na+-K+-ATP酶活性显著低于盐度30, 与潘鲁青[7]报道的在盐度12环境中生活1d和6d均能降低其活性存在一定差异, 这可能与实验鱼的规格和其他环境因子如营养水平等有关[27]。

3.2 温度和盐度对牙鲆幼鱼抗氧化水平的影响

氧自由基反应和脂质过氧化反应是机体新陈代谢活动重要的组成部分, 在正常状态下两者通过不断地协调以维持机体许多生理生化和免疫反应。环境温度和盐度的变化可使鱼体产生大量的活性氧自由基, 在一定范围内, 自由基的产生与机体抗氧化防御过程处于动态平衡中。SOD和CAT是机体抗氧化防御系统的重要组成部分, SOD将氧自由基转化成过氧化氢, CAT进一步将过氧化氢还原成氧分子和水, 使细胞免受过氧化氢的毒害, 保护机体细胞内环境的稳定[28]。SOD和 CAT活性的变化可以准确地反映机体内自由基的代谢情况, 对判断机体的健康状况及抗氧化防御能力具有重要意义[30]。而当体内不断产生和蓄积的自由基超过了机体的清除能力时, 就会产生氧化压力[29—31]。过多的自由基会攻击生物膜, 生成脂质过氧化物(LPO), 并最终分解成丙二醛(MDA)[32]。LPO和MDA可改变生物膜结构,降低细胞膜的流动性, 造成对细胞膜的脂质过氧化损伤。因此, LPO、MDA水平既可判定机体脂质过氧化程度, 也可间接反映自由基产生、生物活性及其抗氧化能力的强弱[33]。

本实验研究结果发现在温度 28℃环境中, 低盐应激使褐牙鲆幼鱼肝脏SOD、CAT活性和MDA含量显著升高, 这与许多学者的研究结果相似。尹飞等研究结果表明适当降低水体盐度可以激活和增强银鲳幼鱼肝脏抗氧化酶活性以消除机体中过多的活性氧自由基[34]。黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)从盐度30转移到盐度10中抗氧化酶活性显著升高[35]。此外, 鱼类对急性温度应激产生的抗氧化反应因种而异。Heise, et al.研究发现海鲶鱼(Zoarces viviparus)从环境温度为12℃转移至18℃、22℃或26℃后2h仅在 26℃环境中其 SOD活性显著降低[36]。淡水鲶鱼(Heteropneustes fossilis)从环境温度25℃急性转入27℃后其 SOD 活性没有显著变化, 而在 32℃和37℃环境中则显著增强[37]。Kammer, et al.研究结果表明水温从20℃降至15℃后1d三刺鱼SOD活性没有发生变化[38]。本实验结果显示褐牙鲆幼鱼从水温20℃升高至 28℃后 1d其肝脏 SOD、CAT活性和MDA含量显著增大, 其原因可能是高温使得鱼的呼吸加剧, 大量的氧自由基产生从而导致机体进行氧化应激反应[39]。温度变化后 6d肝脏 SOD、CAT活性和 MDA含量显著降低, 但各实验组无显著差异, 这可能与机体的营养状况有关, 本实验期间无投饵使得鱼体内氧自由基不断积累, 抗氧化酶的活力不足以抑制细胞内的氧化损伤, 从而使抗氧化酶活性降低。而在温度 28℃, 盐度 10‰实验组肝脏LPO含量显著低于其他各实验组, 这可能与各抗氧化指标在不同环境中的反应不同有关。

3.3 温度和盐度交互作用对褐牙鲆幼鱼的影响

近年来, 温度和盐度对海水硬骨鱼类的交互效应的研究引起了水产研究者的广泛关注[40—42]。本实验发现温度和盐度对褐牙鲆幼鱼皮质醇和渗透压没有明显的互作效应, 说明褐牙鲆幼鱼对环境温度和盐度的耐受性较强, 可通过其自身的生理调整很快适应外界环境的变化。而温度和盐度对褐牙鲆幼鱼鳃Na+-K+-ATP酶活性互作效应明显。在24℃时, 褐牙鲆幼鱼在正常海水中鳃 Na+-K+-ATP酶活性较低,在 28℃环境中, 正常海水中鳃 Na+-K+-ATP酶活性显著高于低盐组, 这可能是因为高温通过改变Na+-K+-ATP酶构象增强与底物的亲和力使得催化效率提高, 且低盐环境与等渗点(盐度 14.97)较为接近, 鳃上皮细胞渗透压调节能力维持在较低水平即可使鱼体渗透压稳定在一定范围内。本实验还显示环境变化后 1d时, 温度和盐度对牙鲆幼鱼肝脏SOD、CAT活性和 MDA含量的互作效应显著, 而环境变化后 6d肝脏 LPO含量有显著的互作效应,这可能与环境条件变化的程度造成褐牙鲆幼鱼体内不同的氧化还原压力有关。高温低盐(温度28℃、盐度10‰)环境中1d时, 牙鲆幼鱼肝脏SOD、CAT活性和 MDA含量显著高于其他各实验组, 与黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)的研究结果一致[35], 而与吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)高温高盐环境会抑制其肝脏SOD和 CAT酶活力的表达有些差异[43],这可能与实验鱼的种类和环境变化的强度有关。

综上所述, 褐牙鲆可耐受温度 20—28℃和盐度30‰—10‰的环境变化, 环境变化后1d高温可显著增强褐牙鲆幼鱼血浆渗透压和鳃 Na+-K+-ATP酶活性, 产生渗透压调节反应。同时, 温度和盐度也显著影响了褐牙鲆幼鱼的抗氧化水平, 环境变化后1d高温低盐(温度28℃、盐度10‰)可增强肝脏抗氧化酶活性和脂质过氧化程度, 至6d可恢复正常。褐牙鲆作为广盐性鱼类, 对环境温度和盐度的适应能力较强, 有利于其在自然水域生态系中生存。而在实际生产中应充分考虑温度和盐度对褐牙鲆幼鱼的交互影响, 尽量减少调整渗透生理耗能, 降低氧化应激,以较好地发挥牙鲆幼鱼的生长潜能。