α—突触核蛋白在常见神经退行性疾病致病机理研究进展

郐子昱

摘要 目前研究表明，α-突触核蛋白功能异常会导致路易小体疾病，以及体的产生。路易小体的产生，被认为是帕金森病（Parkinson disease， PD）的主要病因，而路易小体相关轴退变被认为是阿尔兹海默病（Alzheimers disease， AD）的病理之一。认识突触核蛋白在PD和AD中致病机理才能找到有效的治病方法。突触核蛋白与Aβ蛋白存在紧密关系，在未来通过识别两种蛋白的抗体对PD和AD进行治疗，效果可能会更好。

关键词 α-突触核蛋白 帕金森病 阿尔兹海默病 抗体治疗

α-突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）是第4号染色体q21.3～q22基因编码的高度保守小分子蛋白质，由140个氨基酸组成，正常生理状态下为可溶性天然随机螺旋（非折叠或无序）构象，缺乏二级或三级构象。α-syn一级结构包括3结构域：N端区、NAC区和C端区。①N端区（1～60）由11个氨基酸残基构成7个不完全重复序列XKTKEGVXXXX（X是任意氨基酸）组成，该区易形成两亲性α螺旋，可与脂质与磷脂相结合，在α-syn异常聚集中起重要作用。②NAC区（61～95）：β淀粉样蛋（Aβ）蛋白样成分，是α-syn自我聚积的关键区域，疏水性最强，具有很强的形成β片层结构的趋势。③C端区（96～140）：属于亲水部分，富含脯氨酸残基，具有强酸性和负电荷，在正常状态下α-syn保持无规则卷曲状态的重要区域。突触核蛋白功能尚不明确，目前研究可能存在参与中枢神经系统发育、突触的发育参与调节多巴胺的生物合成，影响神经传递，参与突触前膜囊泡的产生、转运，调节脂质的摄取，维护突触的功能，分子伴侣等功能。其功能异常会导致路易小体疾病（Lewy body disease，LBD），以及体的产生。路易小体的产生，被认为是PD的主要病因，而路易小体相关轴退变被认为是阿尔兹海默病（Alzheimers disease，AD）的病理之一。

一、α-syn与PD帕金森病（Parkinson disease， PD）又称震颤麻痹症，是一种极为常见的神经退行病，其发病率仅次于阿尔兹海默症。在临床上表现为一系列运动障碍，如静止性震颤、肌肉僵直、姿势反射障碍以及运动迟缓、随意运动减少、静止性震颤。此外还存在一些其他运动和非运动障碍。中脑多巴胺能神经功能的减退和破坏是发生PD的主要原因。研究证明，黒质与纹状体存在环路联系。黒质中存在大量多巴胺神经元，其组成的上行多巴胺投射纤维至纹状体，主要功能在于抑制纹状体内乙酰胆碱系统的功能。由于PD患者中脑的黒质发生病变，黒质合成多巴胺能力降低，导致纹状体内乙酰胆碱递质系统功能亢进。目前普遍认为突触核蛋白在PD中的致病机理主要有以下三种机制。1.引起线粒体功能障碍通过电子显微镜检测到A53T突变的转基因小鼠在轴突与树突的线粒体出现膨胀和空泡状的现象，免疫标记法测定线粒体外膜上的P53蛋白增多，P53蛋白可以通过激活Bax，BCL-2途径调节线粒体膜通透性和细胞凋亡。说明突触核蛋白在正常生理功能下，可以抑制P53蛋白引起的线粒体凋亡。研究表明低浓度α-突触核蛋白对线粒体正常运转必不可缺，如果突触核蛋白形成大于600kDa的沉淀就会产生NADH脱氢酶抑制剂的作用，就会对线粒体造成损伤，损伤包括复杂的功能障碍以及氧化应激压力增大，同时淀粉样沉积会改变线粒体膜通透性使细胞色素c流失。细胞色素c与凋亡蛋白激活因子1、caspase9形成复合体，激活caspase9，最终导致细胞死亡。外部和内在的信号通路在某些情况下又相互关联。如caspase9通过蛋白水解促进凋亡因子Bid移位于线粒体诱导细胞色素c释放导致细胞凋亡。利用免疫荧光手段，通过激光扫描共焦显微镜检测了过表达α-syn各片段后与线粒体分布情况。结果证明，α-synN端能够与线粒体共定位；JC1染色流式细胞术检测结果提示，该组细胞线粒体存在膜电位降低趋势。同时被截去N末端的突触核蛋白不会形成高分子量复合体，也不会影响线粒体功能。2.引发内质网应激反应错误折叠的蛋白可导致慢性的内质网应激，并触发一个未折叠蛋白反应（unfolded protein response， UPR）。在生理状态时，内质网相关降解底物一旦从内质网跨膜转位到细胞质，主要依靠泛素蛋白酶体蛋白降解系统（ubiquitin-proteasome system， UPS）进行泛素化、识别、摄入，最终被降解。在细胞出现内质网相关降解底物功能丧失而不能进行上述生物化学过程的代偿时，内质网相关降解底物在细胞质内堆积和聚集，形成非纤维化聚集物。在A53T转基因小鼠模型中，内质网应激效应下游产物eIF2α磷酸化程度显著提高，caspase-12也有显著提高。而对A53T突变的转基因小鼠使用治疗内质网应激的药物Salubrinal，可以明显减轻小鼠病情。突触核蛋白与内质网的结合是非特异性的，一小部分突触核蛋白通常位于内质网微粒体，当出现衰老或其他因素时突触核蛋白形成寡聚化，进而形成不溶聚合物。最初可溶性蛋白和低聚物不暴露在细胞溶质中，后期由于膜的不稳定性使可溶蛋白与寡聚物进入胞质。错误折叠的蛋白可以降低内质网分子伴侣与UPR受体结合活性，这也是为什么内质网应激启动UPR途径后仍然会再次启动细胞凋亡。3.引发泛素-蛋白酶体系统功能异常突触核蛋白单体和二聚体通过分子侣伴介导的自噬（chaperone-mediated autophagy， CMA）途径降解，但寡聚体无法通过CMA途径降解。氧化和硝基化的突触核蛋白可以轻微抑制CMA途径，而磷酸化与多巴胺修饰的突触核蛋白则可完全抑制该途径。研究表明异常的蛋白与溶酶体结合活性增高，但无法被溶酶体内吞。有学者认为突触核蛋白被磷酸化和修饰后，导致构像改变，封锁了溶酶体，使溶酶体摄取与溶解其他蛋白受到干扰，使蛋白降解效率低下。高水平寡聚化突触核蛋白产生毒素消耗葡糖脑苷脂酶，使溶酶体产生功能障碍，促进自身进一步聚集，并形成正反馈，最终致病性超过阈值。在P12和SH-SY5Y细胞系中，CMA途径的抑制没有引起细胞自噬与细胞凋亡。在患者脑部情况不同，细胞自噬体与巨自噬体LC3-I和 LC3-II含量有明显增高，并导致细胞凋亡。endprint

二、α-syn与AD阿尔兹海默病（Alzheimers disease， AD），又称认知障碍症或老年痴呆症，是由于神经元缺失和神经炎症导致的一种神经退行性疾病。临床早期表现主要为患者记忆力的减退和生活自理能力的下降，最终导致发生进行的认知功能障碍和缺失、神经行为异常，出现精神状况及生活自理能力的完全丧失。其主要病理学特征为脑部出现异常蛋白沉积，主要表现为神经元内神经纤维缠结（Neurofibirilary tangle， NFT）的沉积和细胞外β淀粉样蛋白（β-Amyloid， Aβ）的沉积。研究表明双螺旋纤维主要是由过度磷酸化的Tau蛋白组成。细胞外Aβ主要由于淀粉样蛋白前体（amyloid precursor protein， APP）经蛋白酶水解的产物。Aβ级联学说认为由于APP和早老素（Presenilin， PS）基因的突变，产生过多的Aβ或高集聚能力的Aβ1-42在脑组织内沉积，对周围的突触和神经元产生毒性作用，最终引起神经元细胞死亡。突触核蛋白与Aβ，Tau蛋白的毒性作用以及磷酸化都有密不可分的关系。1.α-syn与Aβ1993年Ueda等在阿尔茨海默病（Alzheimer disease， AD）淀粉样斑块中分离到非AB蛋白的成分（nonamyloidβ compound， NAC），后来证实NAC的前体蛋白（nonamyloidβ component precursor， NACP）即为α-syn。1995年Hogyu Han等人体外试验中发现，Aβ在NAC存在的情况下，形成淀粉样纤维速度比自我形成纤维快了近60%。同时发现Aβ也可以促进NAC形成沉淀。实验表明，Aβ与α-syn可以互相促进沉淀形成。Masliah E等人用免疫印迹法发现在AD患者路易小体样斑块中存在α-syn。而且确定了α-syn存在于AD患者淀粉样斑块的边缘部分。说明Aβ与α-syn可能共同诱发了AD。而后的实验发现NACP可以结合Aβl-38和Aβ25-35，而敲去102-131氨基酸的NACP-112也可以与结合Aβl-38和Aβ25-35。而Aβ25-35可以抑制NACP-112与Aβl-38结合。实验数据表明，Aβ25-35是与NACP结合的主要表位。而载脂蛋白E与补体组分C1q被证实可以与Aβl-28结合。研究表明，Aβ1-42可以增强α-syn对神经元的损伤，Aβ寡聚物则可以抑制突触核蛋白介导的囊泡回收。对与α-syn转基因小鼠对比，α-syn/APP转基因小鼠的海马体CA3区最体细胞层的mGluR5与突触核蛋白表达量有明显升高，而mGluR5的升高被认为是产生细胞毒的标志之一。研究表明，Aβ的寡聚物可以提高胞内钙离子，蛋白酶1的水平以及突触核蛋白降解，从而引发caspase-3介导的细胞凋亡。2.α-syn与tau根据定量蛋白组学分析，突触核蛋白与肌动蛋白骨架的许多组分有关系。突触核蛋白与微管的结合可以改变细胞质内多巴胺的传输。而在A30P和A53T突变的小鼠模型中，突触核蛋白并没有显示出微管结合活性。Leo Chen等证明聚集的突触核蛋白可以中断微管的形成，错误折叠可以干扰微管组装而影响轴突运输。Tau蛋白与突触核蛋白可以互相促进聚集，通过亲和层析发现突变的突触核蛋白可以有效诱导tau蛋白聚集以及磷酸化。在A30P突变的转基因小鼠中，突触核蛋白可以诱导Ser202，Thr205，Ser396，Ser404的磷酸化，并使不可溶的肌氨酸增加25%。而磷酸化的Tau蛋白周围并没有大量突触核蛋白聚集。研究表明，A53T突变蛋白可诱导tau蛋白262和356位氨基酸磷酸化，在A53T突变的患者脑部发现，突触核蛋白在Tau蛋白周围聚集。突变的突触核蛋白可以使微管蛋白磷酸化导致微管功能异常，引发JNK细胞凋亡途径。Tau蛋白的磷酸化调节依赖激酶和磷酸酶以及辅助蛋白例如早老素1和突触核蛋白。突触核蛋白可以改变蛋白激酶A和 Ser262活性激酶，调控Tau蛋白的磷酸化。突触核蛋白也可以通过影响囊泡转运调控Tau蛋白的胞间运输运输有学者认为突触核蛋白α-syn通过N端两亲性α-螺旋与囊泡脂质可逆性的连接，通过出芽或翻转方式来调节囊泡的转运。该过程同时受磷酸酶调节，磷酸酶D2可以将中性的磷脂酰胆碱转化为酸性磷脂酸，这种改变有利于突触核蛋白的结合，同时突触核蛋可以抑制磷酸酶D2活性。

三、帕金森病与阿尔兹海默病的抗体治疗单克隆抗体治疗AD时，是使用主动免疫的方法。免疫疫苗AN-1792（人体内聚集的Aβ42）的模型小鼠出现淀粉样斑块的溶解和认知能力亏损改善。但由于老年人的免疫力降低，部分老人接种后未能够出现抗体。在Ⅱ期试验中，多例患者出现了严重的中枢神经系统非细菌性炎症，试验被迫中断。并且在对AN-1792疫苗长期影响的最新研究发现，尽管主动免疫后出现了淀粉样斑块的清理和高抗Aβ抗体滴度，但没有证据显示延迟疾病进展。王加才等人构建含有CpG基元的α-syn核酸疫苗，免疫慢性帕金森模型小鼠。观察小鼠行为学变化及中脑黑质α-syn表达和多巴胺能神经元数目变化，取得良好效果。但在后期实验中发现该核酸疫苗在免疫治疗时发现会加重小鼠中脑黑质区炎症反应。Masliah等用重组人类α-syn（human alpha-synuclein，hα-syn）抗体接种hα-syn转基因PD小鼠，产生了DA神经元保护作用。接种后产生高亲和力抗体，不仅抗体滴度高，而且可识别α-syn的C末端表位；研究表明中枢神经系统循环的hα-syn抗体可识别与神经细胞膜结合的α-syn聚集体，进而激活溶酶体途径促进清除异常聚集的α-syn。我们猜想由于突触核蛋白与Aβ蛋白存在紧密关系，突触核蛋白应该存在某种机制抑制或促进Aβ的寡聚化和纤维沉淀，由于突触核蛋白和Aβ都对神经损伤和神经元缺失有重要贡献，而且两者有结合位点，可以通过可以识别两种蛋白的抗体进行治疗，效果可能会更好。

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