辽宁千山地区含cry8类基因的苏云金芽孢杆菌的分离、克隆与表达

孙钰航++刘艳杰++李海涛++高继国

摘要：QWH132、QZL1-2、QWH 7-2、QZL144-1、QZL144-2、QWH101是笔者所在实验室从辽宁千山地区自行分离的含有cry8类基因的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），具有鞘翅目杀虫活性。本研究在6株菌株中成功发现并克隆了6个靶标生物为鞘翅目的cry8类基因，其中被鉴定为cry8C类、cry8D类、cry8F类（大小为3 525 bp）、cry8K类的基因各有1个，被鉴定为cry8E类的基因有2个，其大小分别为3 534、3 495 bp。后4个基因已在GenBank注册，登记号依次为KC778983、KC778983、KC778984、KC778985。将6个基因插入pEB表达载体，经过PCR检测与 SDS-PAGE 分析证实它们能在大肠杆菌中进行异源表达，这6个基因的表达约有126～128 ku的蛋白，这些菌株中的Cry8蛋白为进一步发掘我国天然的苏云金芽孢杆菌资源与构建新的杀鞘翅目昆虫的高效工程菌提供了重要的试验材料与新思路。

关键词：苏云金芽孢杆菌；大肠杆菌；质粒；cry8基因；克隆；表达；生物信息学分析

中图分类号：Q785文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）10-0028-04

收稿日期：2014-01-07

基金项目：国家“863”计划（编号：2011AA10A203、2010RCB54）。

作者简介：孙钰航（1984—），男，黑龙江牡丹人，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail：weiweiabcd222@163.com。

通信作者：高继国，教授，博士生导师，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail：gaojiguo1961@hotmail.com。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是目前应用最多也是应用最广泛的生物杀虫剂。它是天然的昆虫病原菌，对无脊椎动物中的4个门（包括节肢动物门中的16个目的3 000种以上）的害虫有活性[1]，而对非目标生物安全，从而广泛用于防治鳞翅目（Lepidoptera）、双翅目（Diptera）、鞘翅目（Coleoptera）等农林害虫[2]。苏云金芽孢杆菌能够产生多种杀虫活性物质，其中主要有Cry蛋白、Vip蛋白、Sip蛋白，其中对Cry蛋白与Vip蛋白的研究较深入[3]。随着研究与应用的深入，Bt杀虫基因在杀虫工程菌和转基因抗虫植物广泛应用的过程中已发现多种昆虫在实验室条件下对Bt毒素产生抗性，在田间也发现了具有抗性的个体[4]，因此，筛选、克隆新的高毒力、杀虫谱广且不易产生抗性与交互抗性的基因是解决问题的重要途径之一[5]。Cry8类蛋白质在Bt中分布比较广泛，它们对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有杀灭作用[6]。但目前成功防治鞘翅目害虫的Bt菌株和产品数量还相对较少，鞘翅目害虫是粮食作物、经济作物、园艺和森林的重要害虫，因此分离新的对鞘翅目害虫具有较高杀灭效果的Bt菌株并研究其杀虫蛋白基因，对于开发高效安全的生物杀虫剂和生产转基因作物有重要的理论和实践意义[7]。近些年发现的Bt杀虫活性物质另外一种Sip蛋白也具有鞘翅目害虫活性，Sip蛋白的发现为Bt杀虫活性蛋白提供了一条新思路[8]。笔者所在实验室自行分离出QWH132、QZL1-2、QWH7-2、QZL144-1、QZL144-2、QWH101菌株，经鉴定这些菌株中含有cry8类具有鞘翅目杀虫活性的基因。本研究以这些菌株为模板，分离克隆菌株中的cry8C、cry8D、cry8E、cry8F、cry8K基因，并对其中所含的cry8类基因进行克隆与表达。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源本试验所用菌株分离自辽宁千山采集的土样，采用醋酸钠-抗生素筛选法进行分离[9]。其余菌株质粒见表1。

1.1.2酶及生化试剂2×Taq mix、2 × Primer Star mix均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；其他均为市售国产或进口分析纯或电泳级纯化学试剂。

1.1.3主要仪器主要仪器包括Labnet PCR仪[Multigene Gradient（TC9600-G-230V）]、蛋白电泳仪（BIO-RAD MiNi-PROTEAN Tetra system）、离心机Beckman（AllegraTM64R Centrifuge）、北京赛智创业科技有限公司生产的ChampGel 6000全自动凝胶成像系统Gel Documentation And Image Analysis System等。

1.1.4培养基与抗生素液体LB：蛋白胨 10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，加水定容到1 000 mL，调pH 值为70；固体LB：在液体培养基中加入1.3%琼脂。1/2固体LB：蛋白胨5.0 g，酵母粉2.5 g，NaCl 5.0 g，加水定容至1 000 mL，加入1.3%琼脂，调pH值至7.0；将氨苄青霉素、卡那霉素配制成100 mg/mL的水溶液，经0.22 μm过滤器过滤除菌，-20 ℃ 保存。

1.2方法

1.2.1从土壤中分离Bt菌Bt菌株分离纯化的方法参照文献[10]。表1菌株与质粒

菌株质粒特点描述来源大肠杆菌

（Escherichia coli）Rosetta

F-ompT hsdSB （RB-mB-） gal dcm λ（DE3[lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]） pLysSRARE（CamR）笔者所在实验室

JM109

rpsL（strr）、thr、leu、thi-1、lacY、galK、galT、ara、tonA、tsx、dam、dcm、supE44、Δ（lac-proAB）、[F′，traD36，proAB，laclqZΔM15]笔者所在实验室苏云金芽孢杆菌QWH132笔者所在实验室QZL1-2笔者所在实验室QWH 7-2笔者所在实验室QZL144-1笔者所在实验室QZL144-2笔者所在实验室QWH101笔者所在实验室PlasmidspMD19-T VectorAmprTaKaRa公司pEB