荷花ISSR引物筛选及反应体系优化

徐君等

摘要：利用加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的100条ISSR引物，以2个荷花品种的DNA为模板进行PCR扩增。采用单因素试验方法对荷花ISSR-PCR反应体系的5个因素（Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶）进行浓度优化，确定了荷花ISSR反应的25 μL最佳扩增体系为：10×Taq Buffer 2.5 μL，Mg2+ 3.0 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，引物 1.0 μmol/L，Taq酶 1.00 U，模板DNA 40 ng。筛选出8条扩增条带较好的ISSR引物，并对其引物进行梯度PCR试验，筛选出各引物对应的最佳退火温度，扩增共计获得61条ISSR条带。

关键词：荷花；ISSR 引物筛选；体系优化

中图分类号： S682.320.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0042-03

收稿日期：2013-12-09

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（12）5075]。

作者简介：徐君（1982—），男，江苏苏州人，硕士，助理研究员，主要从事植物细胞工程研究。Tel：（0512）65386213；E-mail：flyforever007@163.com。

通信作者：姜红卫，副研究员，主要从事观赏园艺研究。Tel：（0512）65389221；E-mail：sacjhw@163.com。荷花（Nelumbo nucifera）是我国的十大名花之一，具有较高的观赏价值、经济价值，在食用、药用、园林绿化以及外贸出口等方面有很大的开发潜力[1]。我国是荷花的原产地之一，荷花品种资源十分丰富，近年来，育种工作者利用资源优势，采用自然杂交与人工杂交的方法，育成了大量的荷花新品种。目前，我国记载收编的荷花品种已超过800个。《中国荷花新品种图志》按照植物二元分类法，以种系、株型、花型、花色为分类标准，将荷花分为3系6群16类48型[2]。由于荷花品种数量多、种间差异小、亲缘关系较近，单纯利用少数性状进行定性描述很难阐明荷花品种间的亲缘关系[3]。因此，应采用表型与多态性高、稳定性佳的分子标记技术相结合的方法对荷花种质资源进行研究。ISSR技术在获得大量位点信息的同时，兼具操作简单、快捷、DNA 用量少、技术要求低、成本低以及引物设计无需了解基因组序列等特点，与RFLP、RAPD技术相比，ISSR技术的重复性、稳定性较高[4-6]。目前，ISSR分子标记技术被广泛应用于遗传多样性分析、遗传作图、系统进化关系等领域[7-10]。ISSR技术也存在缺陷，由于各引物间AT、CG比例差异很大，特异退火温度各不相同，如未开展预备试验，将会对试验结果造成不可预计的影响[11]。因此，为获得清晰、可靠、准确的数据，在开展ISSR试验前，进行反应体系优化十分必要。江苏太湖地区农业科学研究所自2010年开始，对太湖地区的荷花资源进行收集、保存、种质鉴定，并进行了大量的相关育种工作。对资源进行鉴定是资源利用的基础，应当采用表型分析结合分子标记分析方法，对所收集的荷花资源的遗传多样性进行评价。本研究优化荷花ISSR最佳反应体系，筛选最佳引物，为保证ISSR扩增结果清晰、可靠、准确，根据特定的ISSR引物设计最佳退火温度，旨在为将ISSR技术应用于荷花种质资源研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

荷花取自江苏省苏州市荷塘月色湿地公园苏州市农业科学院荷花资源保存圃，参试品种包括白千叶、太湖红莲2种。DNA Marker、PCR试剂盒等相关试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。100条ISSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1荷花取样及基因组DNA提取2013年6—7月进行取样，尽量采刚长出的幼叶，取样时采用0.5 cm打孔器于每叶四周、中部各打1孔，每品种取3叶，直接放入离心管中，置于 -70 ℃ 下备用。采用改良的CTAB法[12-13]提取荷花基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳初步检测DNA质量，通过紫外线分光光度计测定260、280 nm处的吸光度值，检测DNA的质量、浓度，提取原液置于-20 ℃保存，将用于PCR反应的DNA工作液进一步稀释至100 ng/μL备用。

1.2.2荷花ISSR反应体系优化选择预备试验中扩增效果较好的引物807，对荷花基因组DNA进行ISSR扩增。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃ 延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃ 终止反应。反应总体积为25 μL，10×Taq Buffer 2.5 μL，Mg2+浓度分别设为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L，dNTP浓度分别设为01、02、0.3、0.4、0.5 mmol/L，引物浓度分别设为02、04、06、0.8、1.0 μmol/L，Taq酶用量分别设为0.25、050、075、100、1.25 U，模板DNA浓度分别为20、40、60、80、100 ng，用灭菌双蒸水补足。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外光下UV凝胶成像系统观察结果，筛选出最佳的反应体系。

1.2.3荷花ISSR引物筛选与梯度PCR反应程序从100条ISSR引物中筛选出扩增结果较好的8条引物用于PCR扩增，扩增体系参照“1.2.2”节。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50～60 ℃（2 ℃/梯度，共6个梯度）退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃ 终止反应。电泳及凝胶观察方法同“1.2.2”节，筛选出各引物的最佳退火温度。

2结果与分析

2.1基因组DNA提取与检测

检测同一批提取的 DNA 样品，结果表明，主带明亮，略有拖尾现象，说明CTAB DNA快速提取法效果好，但存在少许DNA降解现象（图1）。

2.2各因素水平对ISSR扩增反应的影响

选用白千叶、太湖红莲，检验Mg2+浓度、dNTP浓度、Primer浓度、Taq酶、模板DNA浓度各因素对ISSR扩增反应的影响，结果如图2所示。

2.2.1Mg2+浓度对ISSR-PCR的影响由图2-a可知，当Mg2+浓度超过1.5 mmol/L时，大部分扩增条带亮度较好，特异性较强；Mg2+浓度较高时易与dNTP、引物、模板结合，影响模板与引物的结合率，产生非特异性，出现弥散的带。本试验中，当Mg2+浓度小于3.5 mmol/L时，并未出现以上现象；当Mg2+浓度为1.5～3.5 mmol/L时，条带无显著差异，清晰明亮，说明以上浓度均适宜荷花ISSR反应，在实际反应中Mg2+浓度采用3.0 mmol/L。

2.2.2dNTP 浓度对 ISSR-PCR 的影响dNTP浓度过低会导致产率下降，条带亮度不足。由图2-b可知，当dNTP浓度为0.1 mmol/L时；条带很亮；当dNTP浓度大于0.2 mmol/L时，产生了错配现象，形成了2条非特异条带。综合考虑各方面因素，实际反应中dNTP浓度采用0.1 mmol/L。

2.2.3引物浓度对 ISSR-PCR 的影响由图2-c可知，引物浓度过高易形成引物二聚体，影响PCR扩增。因此实际操作中应避免选择过高的引物浓度，综合考虑各方面因素，实际反应中引物浓度采用1.0 μmol/L。

2.2.4模板 DNA浓度对 ISSR-PCR 的影响由图2-d可知，模板 DNA浓度对 ISSR-PCR影响不大，当模板DNA总量达100 ng时，扩增条带偏暗，说明模板DNA浓度过高会抑制扩增结果，综合考虑各方面因素，实际反应中采用25 μL反应体系加入40 ng模板DNA。

2.2.5Taq酶浓度对 ISSR-PCR 结果的影响由图2-e可知，当Taq酶用量小于1.0 U时条带相对较暗，当用量为 1.25 U 时条带开始弥散，因此实际操作中Taq酶浓度过低或者过高都不可取，实际反应中采用25 μL反应体系加入1 U TaqDNA聚合酶。

2.2.6荷花ISSR扩增最优化体系经上述试验，荷花ISSR扩增建立25 μL反应体系（表1）。

表1荷花ISSR优化体系

成分最终浓度/使用量加入量（μL）10×Taq 酶1×2.5 25 mmol/L Mg2+3.0 mmol/L3.0 2 mmol/L dNTP0.2 mmol/L2.5 25 μmol/L Primer1.0 μmol/L1.0 5 U/μL Taq酶1.00 U0.2 25 ng/μL模板DNA40 ng1.0 灭菌 ddH2O14.8

2.3荷花ISSR引物筛选及退火温度对各引物扩增的影响

2.3.1荷花ISSR引物的筛选结果选取白千叶、太湖红莲2个荷花品种，以基因组DNA为模板，分别对加拿大哥伦比亚大学（UBC）所设计的100条引物，按照“2.2”所述最佳反应条件及体系进行PCR扩增，筛选出37条有条带的引物。比对2个品种的扩增结果，选择了8个荷花ISSR扩增最佳引物，具体引物编号及序列如表2所示。

2.3.2退火温度对ISSR引物扩增的影响8个ISSR引物用6个退火温度进行扩增，结果表明，所有引物均出现不同退火温度扩增带型差异的情况。选择各引物扩增重复性好、扩增条带清晰的退火温度为最佳退火温度，退火温度与合成报告单上的Tm趋势有关，但不完全一致。各引物的最佳退火温度如表2所示，8个引物共扩增出61条条带（图3）。

表28个荷花ISSR引物序列及各引物的最佳退火温度

引物编号引物序列

（5′→3′）最佳退火温度

（℃）ISSR带数

（条）807（AG）8T585808（AG）8C589836（AG）8YA6010840（AG）8YT608842（GA）8YG6011845（CT）8RG585846（CA）8RT586848（CA）8RG587

3结论与讨论

ISSR分子标记受多种因素的影响，虽然ISSR较RAPD、RFLP等第一代标记稳定，但是试验的可靠性、稳定性仍然与PCR反应条件有很大关系[14-15]。PCR体系中的Taq酶浓度、Mg2+浓度、引物浓度、dNTP浓度、模板DNA浓度均为重要反应条件。本试验表明，荷花ISSR反应中各试剂在较广的浓度范围均可得到较好的扩增结果，荷花ISSR反应25 μL扩增体系：10×Taq Buffer 2.5μL，Mg2+ 3.0 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，引物1.0 μmol/L，Taq酶 1.0 U，模板DNA 40 ng。本研究筛选了加拿大哥伦比亚大学（UBC） 公布的100条引物，从中筛出8条扩增出稳定、较亮条带的引物专门用于荷花遗传多样性鉴定。本试验显示，退火温度是荷花 ISSR 成功与否的决定性因素，退火温度过低，会引起错配，产生非特异条带，严重影响试验结果的准确性；退火温度过高，会干扰模板与引物结合，降低扩增产量，严重影响读带。本研究筛选的所有引物均出现退火温度不同、扩增带型不同的情况，因此，ISSR扩增前应当通过梯度PCR，精确确定所筛选的 ISSR 引物对应于荷花基因组DNA扩增的最适退火温度。本研究筛选的8个ISSR引物为807、808、836、840、842、845、846、848，结合优化的PCR体系、最佳的特定引物退火温度，可扩增61条ISSR条带，ISSR扩增结果较好。荷花ISSR-PCR技术成本低廉、操作简便、可靠性高，能提供大量遗传信息，可用于大量鉴定荷花种质资源。

参考文献：

[1]中国科学院武汉植物研究所. 中国莲[M]. 北京：科学出版社，1987：1-3.

[2]王其超，张行言. 中国荷花品种图志[M]. 北京：中国林业出版社，2005：7-9.

[3]Han Y C，Teng C Z，Chang F，et al. Analyses of genetic relationships in Nelumbo nucifera using nuclear ribosomal ITS sequence data，ISSR and RAPD markers[J]. Aquatic Botany，2007，87（2）：141-146.

[4]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20（2）：176-183.

[5]胡建斌，李建吾. DNA分子标记在几种重要的茄科蔬菜遗传改良中的应用[J]. 江西农业学报，2007，19（4）：33-36，39.

[6]Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al. AFLP：a new technique for DNA finger-printing[J]. Nucl Acide Res，1995，23（21）：4407-4414.

[7]唐玉海，崔香菊，郭春芳.ISSR分子标记及其在茶树遗传育种上的应用研究进展[J]. 福建教育学院学报，2008（4）：116-119.

[8]王国霞. 古银杏雄株遗传多样性的ISSR分析及花粉用优良单株初步选育研究[D]. 南京：南京林业大学，2007.

[9]刘威生，冯晨静，杨建民，等. 杏ISSR反应体系的优化和指纹图谱的构建[J]. 果树学报，2005，22（6）：626-629.

[10]谢启鑫，缪南生，宋小民，等. 蝴蝶兰种质资源遗传多样性的ISSR分析[J]. 西北植物学报，2010，30（7）：1331-1336.

[11]黄宇，何天友，荣俊冬，等. 荷花ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J]. 亚热带农业研究，2009，5（4）：284-288.

[12]张青林，罗正荣. ISSR及其在果树上的应用[J]. 果树学报，2004，21（1）：54-58.

[13]Dolye J J，Dolye J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochem Bul，1987，9（1）：11-15.

[14]杨金华，秦瑞云，付庆云，等. 菠菜ISSR-PCR体系的建立与优化[J]. 江苏农业科学，2013，41（2）：36-38.

[15]孙清信，陈坚，张辉，等. 紫云英ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化[J]. 植物遗传资源学报，2012，13（5）：870-878.

参考文献：

[1]中国科学院武汉植物研究所. 中国莲[M]. 北京：科学出版社，1987：1-3.

[2]王其超，张行言. 中国荷花品种图志[M]. 北京：中国林业出版社，2005：7-9.

[3]Han Y C，Teng C Z，Chang F，et al. Analyses of genetic relationships in Nelumbo nucifera using nuclear ribosomal ITS sequence data，ISSR and RAPD markers[J]. Aquatic Botany，2007，87（2）：141-146.

[4]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20（2）：176-183.

[5]胡建斌，李建吾. DNA分子标记在几种重要的茄科蔬菜遗传改良中的应用[J]. 江西农业学报，2007，19（4）：33-36，39.

[6]Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al. AFLP：a new technique for DNA finger-printing[J]. Nucl Acide Res，1995，23（21）：4407-4414.

[7]唐玉海，崔香菊，郭春芳.ISSR分子标记及其在茶树遗传育种上的应用研究进展[J]. 福建教育学院学报，2008（4）：116-119.

[8]王国霞. 古银杏雄株遗传多样性的ISSR分析及花粉用优良单株初步选育研究[D]. 南京：南京林业大学，2007.

[9]刘威生，冯晨静，杨建民，等. 杏ISSR反应体系的优化和指纹图谱的构建[J]. 果树学报，2005，22（6）：626-629.

[10]谢启鑫，缪南生，宋小民，等. 蝴蝶兰种质资源遗传多样性的ISSR分析[J]. 西北植物学报，2010，30（7）：1331-1336.

[11]黄宇，何天友，荣俊冬，等. 荷花ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J]. 亚热带农业研究，2009，5（4）：284-288.

[12]张青林，罗正荣. ISSR及其在果树上的应用[J]. 果树学报，2004，21（1）：54-58.

[13]Dolye J J，Dolye J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochem Bul，1987，9（1）：11-15.

[14]杨金华，秦瑞云，付庆云，等. 菠菜ISSR-PCR体系的建立与优化[J]. 江苏农业科学，2013，41（2）：36-38.

[15]孙清信，陈坚，张辉，等. 紫云英ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化[J]. 植物遗传资源学报，2012，13（5）：870-878.

参考文献：

[1]中国科学院武汉植物研究所. 中国莲[M]. 北京：科学出版社，1987：1-3.

[2]王其超，张行言. 中国荷花品种图志[M]. 北京：中国林业出版社，2005：7-9.

[3]Han Y C，Teng C Z，Chang F，et al. Analyses of genetic relationships in Nelumbo nucifera using nuclear ribosomal ITS sequence data，ISSR and RAPD markers[J]. Aquatic Botany，2007，87（2）：141-146.

[4]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20（2）：176-183.

[5]胡建斌，李建吾. DNA分子标记在几种重要的茄科蔬菜遗传改良中的应用[J]. 江西农业学报，2007，19（4）：33-36，39.

[6]Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al. AFLP：a new technique for DNA finger-printing[J]. Nucl Acide Res，1995，23（21）：4407-4414.

[7]唐玉海，崔香菊，郭春芳.ISSR分子标记及其在茶树遗传育种上的应用研究进展[J]. 福建教育学院学报，2008（4）：116-119.

[8]王国霞. 古银杏雄株遗传多样性的ISSR分析及花粉用优良单株初步选育研究[D]. 南京：南京林业大学，2007.

[9]刘威生，冯晨静，杨建民，等. 杏ISSR反应体系的优化和指纹图谱的构建[J]. 果树学报，2005，22（6）：626-629.

[10]谢启鑫，缪南生，宋小民，等. 蝴蝶兰种质资源遗传多样性的ISSR分析[J]. 西北植物学报，2010，30（7）：1331-1336.

[11]黄宇，何天友，荣俊冬，等. 荷花ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J]. 亚热带农业研究，2009，5（4）：284-288.

[12]张青林，罗正荣. ISSR及其在果树上的应用[J]. 果树学报，2004，21（1）：54-58.

[13]Dolye J J，Dolye J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochem Bul，1987，9（1）：11-15.

[14]杨金华，秦瑞云，付庆云，等. 菠菜ISSR-PCR体系的建立与优化[J]. 江苏农业科学，2013，41（2）：36-38.

[15]孙清信，陈坚，张辉，等. 紫云英ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化[J]. 植物遗传资源学报，2012，13（5）：870-878.