活性污泥中异养硝化-好氧反硝化菌的分离及其脱氮性能

曹 林，衣学文，2，董 滨，鲁 超，黄 鑫，丁国际

（1.上海大学环境与化学工程学院，上海 200444；2.金山环境监测站，上海 201500；3.同济大学环境科学与工程学院，上海 200092）

异养硝化－好氧反硝化技术是一种利用异养微生物在好氧条件下进行直接脱氮，与A/A/O技术相比具有以下特点［1］:(1)不需要分别进行硝化和反硝化，简化了工艺；(2)不需要为反硝化投加额外碳源；(3)由于异养细菌可以利用有机碳源、异养硝化－好氧反硝化菌在去除氮污染物的同时还可以去除有机碳污染物。异养硝化－好氧反硝化技术由于这些特点日益受到关注。

Kshirsagar等［2］将从土壤中分离的 Paracoccus pantotrophus投入氧化沟后，与未投菌的对照系相比，硝化和反硝化率分别提高了10%和20%。Kulkarni等［3］采用Thiosphaera pantotropha处理300mg/L的硝基酚废水，去除率达90%以上。Zhang等［4］从猪粪污水中分离出一株Pseudomonas stutzeri YZN－001，该菌株具有良好的异养硝化和好氧反硝化能力，并且在低温下对铵的去除能力尤为显著。Chen等［5］从猪场废水中分离出一株 Rhodococcus sp.CPZ24，该菌株在25h内将85%的100mg/L氨氮转化为13%硝氮、24%细胞内氮以及48%气态的反硝化产物。异养硝化－好氧反硝化技术的应用性与能否得到高效的异养硝化－好氧反硝化菌有关，为此本研究重点进行高效异养硝化－好氧反硝化菌的筛选和硝化脱氮特性的研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 活性污泥

活性污泥样品取自上海某城市污水处理厂二沉池回流污泥。

1.1.2 细菌培养基

细菌培养所用的BTB培养基［6］、异养硝化培养液［7］、牛肉膏蛋白胨培养基［8］，试剂均购自上海国药(集团)化学试剂有限公司，分析纯。

1.1.3 仪器和设备

试验所用的主要仪器和设备:双光束紫外可见分光光度计UV－4802型(上海尤尼克仪器有限公司)；分光光度计DR/800型(美国哈希公司)；高速冷冻离心机5804R型(上海飞鸽仪器有限公司)；低温生化培养箱LRH－150型(上海一恒科学仪器有限公司)；气浴恒温振荡器CHA－S型(江苏金坛市江南仪器厂)；倒置生物显微镜37XB型(上海光学仪器五厂)；冷冻干燥机LGJ－12型(宁波新芝生物科技股份有限公司)；扫描电镜JSM－6700F型(日本JEOL公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 好氧反硝化细菌分离、培养和纯化

将活性污泥用无菌水稀释后涂布到BTB平板培养基上后，于30℃下培养2 d。在平板上挑选出周围显蓝色的菌落［6］，在牛肉膏蛋白胨平板培养基上划线分离纯化5次，最后将菌种接种到试管的牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基上，于30℃下培养成菌落后，置于4℃冰箱中保存。

1.2.2 异养硝化－好氧反硝化菌的筛选

将斜面培养基中的菌种接种到异养硝化培养液中，于30℃下振荡培养2 d，检测到培养液中氨氮浓度明显下降的菌种即为异养硝化－好氧反硝化菌［9］。

1.2.3 异养硝化－好氧反硝化菌的鉴定

将菌株用100μL水稀释，沸水浴煮5min，进行菌落PCR。用于16S rRNA PCR反应的引物为1对通用引物，即正向引物为27f(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’)和反向引物为1492r(5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR体系建立(50μL):DNA模板10 pmol，正反引物(10μmol/L)各1μL，dNTP混合物(10mmol/L)1μL，10×Taq反应缓冲液5μL，Taq聚合酶(5μ/μL)0.25μL，加水至50μL。PCR反应条件:98℃预变性5mim；循环95℃、35 s，55 ℃ 、35 s，72 ℃、90 s，进行 35个循环，最后72℃延伸8min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，进行16S rRNA测序，测序结果提交GenBank进行BLAST检索。

1.2.4 异养硝化－好氧反硝化菌的硝化脱氮性能分析

菌悬液的制作:将异养硝化－好氧反硝化菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中于30℃下振荡培养1 d，离心收集，并以无菌水清洗三次，最后用无菌水调节OD600至0.6～0.8，平板计数结果表明此时细菌在水中浓度约107CFU/mL。

硝化脱氮性能测试:将菌悬液以5%(体积比)的量接种至异养硝化培养液中，做3个平行样，于30℃恒温振荡器中培养2 d，每隔12h取样分析培养液中的水质。

1.2.5 水质分析

NH3－N、TN、－N、－N等水质指标的测定参照《水和废水监测分析方法》(第四版)［10］中的标准方法，其中NH3－N采用纳氏试剂光度法，TN采用过硫酸钾氧化紫外分光光度法，－N采用紫外分光光度法，－N采用N－(1－萘基)－乙二胺光度法。

2 结果与讨论

2.1 异养硝化-好氧反硝化菌的筛选

从BTB培养基中筛选出10株好氧反硝化菌，分别编号为CL1～CL10，保存在试管斜面培养基中。将试管斜面培养基中的菌种分别接种至异养硝化培养液中在温度30℃的条件下进行培养，培养液中氨氮初始浓度为50mg/L，碳氮比(COD/NH3－N)为20，pH为7，48h 后各菌株对氨氮的去除率如图1所示。10株好氧反硝化菌中，有3株菌株对氨氮的去除率较高，超过了60%，说明具有异养硝化能力，是异养硝化－好氧反硝化菌，这3株菌株分别为CL1、CL6和CL9，因此对这三株菌株作了进一步研究。

图1 不同菌株对氨氮的去除率Fig.1 Effect of Different Strains on Removal Rate of Ammonia Nitrogen

2.2 异养硝化-好氧反硝化菌的鉴定

三株菌株的扫描电镜(SEM)照片，如图2～图4所示。由图可知CL1和CL9菌皆为长杆菌，而CL6菌为短杆菌。CL1、CL6和CL9菌的平均大小分别为0.5μm×1.4μm、0.5μm ×0.8μm 和0.5μm ×1.9μm。

图2 CL1的扫描电镜照片ig.2 SEM Analysis of Strain CL1

图3 CL6的扫描电镜照片ig.3 SEM Analysis of Strain CL6

图4 CL9菌的扫描电镜照片ig.4 SEM Analysis of Strain CL9

三株菌株经16S rRNA基因序列测定，通过BLAST检索与GenBank中的核酸序列进行同源性比对，表明菌株CL1和CL9与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis(模式菌株IAM 12118，GenBank授权号AB042061)有99%的相似性，菌株CL6与土地戈登氏菌Gordonia terrae(模式菌株NML88－1049，GenBank授权号DQ180334)同源性较高，为99%。

根据三株菌株的形态特征、生理生化特性和16S rRNA鉴定结果，确定CL6为G.terrae，而由于CL1和CL9在菌株形态上稍有不同，因此它们应同属于B.subtilis的亚种或变种［11］。分别命名 CL1、CL6和CL9菌为B.subtilis CL1，G.terrae CL6和B.subtilis CL9，将其16S rRNA基因序列提交至GenBank得授权登录号 JN862636、JN862637、JN8626388。

2.3 异养硝化-好氧反硝化菌的硝化脱氮特性

在以柠檬酸钠为唯一碳源、硫酸铵为唯一氮源，初始氨氮浓度为50mg/L、碳氮比(COD/NH3－N)为20、培养液pH为7、温度为30℃的条件下，以5%(体积比)的量接种B.subtilis CL1和B.subtilis CL9菌悬液，两菌的生长情况较好，对水中的氨氮和总氮有较高的去除率；G.terrae CL6(以5%体积比的量接种菌悬液)在以乙酸钠为唯一碳源、硫酸铵为唯一氮源、初始氨氮浓度为50mg/L、碳氮比(COD/NH3－N)为20、培养液pH为7、温度为30℃的条件下，生长情况和对氨氮和总氮的去除效果均较好。三株异养硝化－好氧反硝化菌的硝化脱氮特性显示在图5～图7中。

图5 B.subtilis CL1的硝化脱氮特性Fig.5 Nitrification Denitrification Charactristics of B.subtilis CL1

图6 B.subtilis CL9的硝化脱氮特性Fig.6 Nitrification Denitrification Charactristics of B.subtilis CL9

图7 G.terrae CL6的硝化脱氮特性Fig.7 Nitrification Denitrification Charactristics of G.terrae CL6

由于B.subtilis CL1和 B.subtilis CL9同属于B.subtilis的亚种或变种，两菌的16S rRNA相似性为99%，因此它们的生长情况和硝化脱氮特性表现较一致。由图5和图6可知在试验过程中，B.subtilis CL1和B.subtilis CL9的生长曲线(OD600)在前36h内呈直线上升，为对数生长期阶段，随后两菌逐渐进入静止期。培养液的氨氮浓度在前36h内直线下降，36h时 B.subtilis CL1和 B.subtilis CL9对氨氮的去除率分别为90%和86%，随后氨氮浓度的下降趋势趋于平缓，48h时两菌对氨氮的去除率皆达到了99%。总氮浓度的变化始终呈直线下降，48h时B.subtilis CL1和B.subtilis CL9对总氮的去除率分别为98%和96%。在此过程中，系统内没有检测到亚硝酸盐氮，但检测出有硝酸盐氮的累积；随着时间的延长，硝酸盐氮浓度先升高后降低，在24h时累积最大，约11mg/L，48h时降为零。以上说明两菌在好氧条件下先将氨氮氧化为硝酸盐氮，再使硝酸盐氮还原为含氮气体从水中脱除，两菌的异养硝化作用优于好氧反硝化作用，因此在硝化和脱氮过程中有硝酸盐氮的累计。

与B.subtilis CL1和 B.subtilis CL9不同，G.terrae CL6的生长趋势随时间的变化有3个明显的阶段:停滞期、对数期和衰亡期(如图7)。菌株在接种后的12h进入对数生长期，24h生长速度最快，36h细菌细胞密度(用吸光度OD600来表示)达到最高，随后进入衰亡期。由图6可知，氨氮减少与细菌的生长有相反的趋势，氨氮在12h时进入快速去除期，36h时氨氮的浓度由最初的54.6mg/L降至5.8mg/L，去除率为89%。随后氨氮的降解速度变慢，最终在48h时得到全部去除。G.terrae CL6在异养硝化过程中，总氮的去除率与氨氮的去除率保持一致，系统内无亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的累积，48h时总氮去除率达100%。

由以上三株菌株的硝化和脱氮特性可知，氨氮和总氮的快速去除期与细菌的对数生长期是一致的，这与Verstraete［12］报道的异养硝化－好氧反硝化作用普遍发生于老龄细胞中的结论不同，而与Su等［13］和张培玉等［14］的研究结果一致。目前的研究表明异养硝化－好氧反硝化作用与菌株体内的氨单加氧酶、羟胺氧化酶和周质硝酸还原酶等有密切关系［15］，但是不同菌株的氨单加氧酶、羟胺氧化酶和周质硝酸还原酶序列相似性不完全一样［16］，因此就可能导致不同的异养硝化－好氧反硝化菌有不同的氨氮和总氮代谢机制。

比较三株异养硝化－好氧反硝化菌的硝化脱氮特性，B.subtilis CL1和B.subtilis CL9在脱氮过程中有硝酸盐氮的累积，而G.terrae CL6在脱氮过程中却没有检测出硝酸盐氮，因此G.terrae CL6比其他两菌具有更好的好氧反硝化能力，能将异养硝化过程中产生的硝酸盐氮和亚硝酸盐氮迅速还原为含氮气体从水中脱除。

综合以上结果，三株菌株都显示出较强的异养硝化－好氧反硝化能力，在温度为30℃、碳氮比为20、pH为7的条件下，48h之内就能将50mg/L的氨氮几乎全部脱除，这比林燕等［17］所报道的Bacillus sp.LY效率高，但与张培玉等［14］报道的Pseudomonas sp.QY37和Joo等［18］所报道的Alcaligenes faecalis No.4相比还有一定的差距，因此三株菌株的硝化和脱氮能力还有待提高。不过，G.terrae CL6在异养硝化－好氧反硝化的过程中没有硝酸盐氮的累积，将有良好的应用前景。

3 结论

(1)从活性污泥中分离筛选出三株异养硝化－好氧反硝化菌，根据其形态特征、生理生化特性和16S rRNA鉴定结果，确定两株为Bacillus subtilis，另一株为Gordonia terrae，因此分别命名这三株菌株为B.subtilis CL1，G.terrae CL6和 B.subtilis CL9。

(2)在以柠檬酸钠为唯一碳源、硫酸铵为唯一氮源、初始氨氮浓度为50mg/L、碳氮比(COD/NH3－N)为20、异养硝化培养液pH为7、温度为30℃的条件下，B.subtilis CL1和B.subtilis CL9在培养48h后对培养液中的氨氮去除率为99%，对总氮的去除率分别为98%和96%；在此期间系统内有硝酸盐氮累积，在24h时累积量最大为11mg/L，随后硝酸盐氮浓度逐渐下降，48h时为零。

(3)在以乙酸钠为唯一碳源、硫酸铵为唯一氮源、初始氨氮浓度为50mg/L、碳氮比(COD/NH3－N)为20、异养硝化培养液pH为7、温度为30℃的条件下，G.terrae CL6在培养48h后对氨氮和总氮的去除率均达到100%，期间无亚硝酸盐氮或硝酸盐氮的累积。

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