大孔吸附树脂吸附分离FK506的工艺研究

诸敏

摘 要 目的：研究并优化FK506提取工艺。方法：通过几种大孔吸附树脂的吸附容量及分离能力比较实验，筛选到一种吸附容量高又有分离能力的树脂；通过吸附等温线及柱分离实验，确定最佳吸附浓度、上样及洗脱流速等工艺参数。结果： FK506提取液通过HZ816树脂吸附分离掉杂质，中间体湿粉含量达到60.1%（折干含量81.3%），吸附分离总收率达87.1 %。结论：HZ816树脂可有效吸附分离FK506。

关键词 FK506 树脂 吸附

中图分类号：TQ460.64 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2014）21-0071-04

Study on the technology for the isolation and purification

of FK506 by macroporous resin

ZHU Min*

（Hangzhou Zhongmei Huadong Pharmaceutical Co. Ltd.， Hangzhou 310011， China）

ABSTRACT Objective： To optimize the technology for the isolation and purification of FK506. Methods： A macroporous absorption resin with high adsorption and separation capability was selected through experiments based on its adsorption capability and separation ability. Process parameters such as the volume and the optimum adsorption concentration of sample and the elution flow were determined via adsorption isotherm and column separation experiments. Results： The content of the wet powder of FK506 intermediate was 60.1% （81.3% on dry content） through the adsorption of impurities from FK506 extracts by resin HZ816 with total yield of 87.1%. Conclusion： FK506 can be effectively separated and purified by macroporous resin HZ816.

KEY WORDS FK506； resin； adsorption

FK506（他克莫司）系新一代免疫抑制剂，是继环孢素之后的一个重大发现。通过体外、动物和临床研究证实，其剂量在低于环抱素10倍的情况下即可起到很好的免疫抑制作用，且毒副反应比环孢素小[1-2]。但是，在FK506的生产过程中，由于发酵液中有效组分单位较低，并有多个他克莫司类似物，包括FK520（即：子囊霉素）和2H-FK506（二氢他克莫司）等杂质，它们的结构与他克莫司极为相似[3]。并且，FK506 和FK506异构体Ⅰ及Ⅱ在溶剂中相互转化[4]，导致分离难度大，提取收率低。为了提高产品质量、降低生产成本，对提取工艺作了进一步研究，本文主要研究采用树脂分离纯化FK506中间体的工艺技术。

材料与方法

材料与仪器

HZ816，HZ818，HZ820型大孔吸附树脂（上海华震树脂厂）；X-5型大孔吸附树脂（天津南开大学树脂厂）；FK506萃取脱色浓缩液（本公司自制）；丙酮，去离子纯化水，乙酸乙酯，乙醇等均为分析纯；玻璃层析柱：45 mm ×1 000 mm；SHZ-3型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；RE-201D旋转蒸发器（上海一凯仪器设备有限公司）；W201B恒温水浴锅（上海申胜生物技术有限公司）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）。

方法

HPLC检测方法

色谱柱（Eclipse XDB-C8，4.6 mm×150 mm，5 ?m），流动相为0.1%磷酸水-乙腈（60：40→ 44：56），梯度洗脱 1 h），流速1.0 ml/min，柱温60 ℃，进样量20 ml，检测波长210 nm。

大孔吸附树脂吸附容量比较

FK506提取液中含有多个组分及色素和油脂等杂质，根据树脂吸附原理[5]及FK506在各种溶剂中的溶解度大小，选用孔径适合、比表面大的吸附树脂HZ816、HZ818、HZ820、X-5各3 g分别装入50 ml的三角瓶中；取FK506萃取脱色浓缩液25 ml，效价88.356 mg/ml，加丙酮和适量纯水稀释后效价为41.217 mg/ml，每份取12 ml分别加入上述吸附树脂中。室温（24 ℃）下振荡吸附4 h，过滤后用HPLC测定吸附液中残余的FK506效价。

吸附等温线试验

在50 ml锥形瓶中加入3 g经处理的吸附树脂共5份，每份加入20 ml FK506溶液，效价分别为15、30、45、60、75 mg/ml，室温（24 ℃）下振摇4 h，用HPLC测定溶液中残余的FK506的效价，计算树脂的吸附容量。

吸附及解吸

取直径4.5 cm玻璃柱，装入HZ816树脂500 ml，先用丙酮洗脱再生，至流出液的丙酮与水混合不显白色浑浊为止（取1 ml流出液加5 ml蒸馏水），然后用大量纯化水洗脱至无丙酮味后备用。取FK506萃取脱色浓缩液54 ml，效价92.056 mg/ml，浓缩液加适量丙酮和纯水稀释后（效价：48 121 mg/ml）上柱，上样吸附流速2.5 ml/min；上样完毕先用丙酮-纯水（3∶7）的混合溶液作解吸剂洗脱1.5倍柱体积，再用丙酮-纯水（7∶3）的混合溶液作解吸剂洗脱，控制流速5 ml/min，分部收集（每流分220 ml），用HPLC测定效价，计算、比较收率。

浓缩和沉淀

收集合并大于1.0 mg/ml解吸液，减压、60 ℃浓缩至有白色固体粉末析出、浓缩液变清，移入5 ℃冰箱中放置1 d过滤，所得粉末按上述HPLC检测方法测FK506含量。

结果与讨论

树脂吸附容量

试验了4种不同树脂静态吸附提取液中FK506的效果（表1），按下式计算树脂饱和吸附量[6]：饱和吸附量（mg/g）=（样品溶液中FK506总量-吸附后残余的FK506总量）/树脂质量。

从表1可见，HZ816树脂比其它几种树脂吸附容量大，这是由于树脂孔径、比表面积、孔容及极性的不同导致吸附的能力的差异，而选用的HZ816树脂有较大的比表面积及适合的孔径；同时，加丙酮增加萃取脱色浓缩液的流动性及加适量水增大极性和减小溶解度，有利树脂吸附FK506。

吸附等温曲线

HZ816树脂在浓度不同的FK506溶液中对FK506进行吸附，其吸附等温线试验结果见图1。

从图1可见，该等温吸附曲线与Langmugir方程[7]吻合。树脂吸附量随溶液中FK506浓度提高而变大，当浓度提高到50 mg/ml以上时，其吸附容量提高幅度变小，而溶液黏度却增大，考虑到萃取脱色浓缩液效价浓度在75 mg/ml时，上柱吸附流速极小，因此对萃取脱色浓缩液需加溶剂丙酮增加萃取脱色浓缩液的流动性，但要控制FK506溶液浓度在最佳吸附效价。综上实验分析得出，可采用50 mg/ml浓度作为最佳吸附效价。

解吸

HZ816树脂解吸实验结果见表2。

从表2实验数据可见，前2个流分可分离去除大量色素等杂质，提高了洗脱流分的纯度，并且洗脱液单位集中，合并所收集的3～8解吸流分共1 301 ml，效价3.520 mg/ml，解吸收率达92.1 %。由于解吸流速小，有利交换洗脱，提高解吸液单位，故本实验采用1/100（v/v·min）流速解吸。对选用的解吸溶剂必须能使大孔吸附树脂溶胀，减少溶质与树脂间吸附力，同时使吸附物容易溶解，故本实验采用丙酮-纯水（3∶7）的混合溶剂洗脱，可去掉部分极性大的杂质，然后用70%丙酮水溶剂解吸附的FK506。

解吸液的质量考察

收集的解吸液于60 ℃减压浓缩至有白色固体粉末析出、浓缩液变清，移入5 ℃冰箱中放置1 d，抽滤，获得白色粉末，按上述HPLC检测方法测FK506重量含量为60.1%，折干含量（即粉末干燥除去水分后的重量含量）：81.3%，组分（即FK506归一含量）：达到91%左右，显著提高了中间体（图2）质量。中间体经精制可得高纯度FK506成品（图3），可见，采用HZ816树脂吸附分离杂质，对后续精制工艺非常有利。

解吸液于60 ℃减压浓缩过程中，随着浓缩液中丙酮量的减少，相对含水量增大，FK506在浓缩液中溶解度降低，有固体粉末析出，至浓缩液变清时，FK506已基本析出，移入5 ℃冰箱中放置1 d，随着温度降低溶液中的FK506不断析出，使固体粉末变粗，从而有利后续的抽滤并提高收率。

讨论

HZ816树脂可分离去除FK506萃取脱色浓缩液中的油脂、色素等杂质，比相关美国专利报道采用硅胶等一些分离介质效果好，工艺操作简便[8]。通过HZ816树脂分离所得FK506白色（或类白色）固体粉末，经精制可得高纯度FK506。产品质量达到国内外药典质量要求，可与美国专利报道的质量媲美[9]。采用HZ816树脂取代硅胶分离介质不仅收率高，而且树脂可再生重复使用，有益环保。

参考文献

张炜. 新型免疫抑制剂FK506[J]. 临床皮肤科杂志， 1995， 24（1）： 47.

周吉海， 谭季春. FK506 的发现和开发应用[J]. 日本医学介绍， 1994， 15（6）： 267-268.

温耀明， 肖丽华， 庄鸿， 等. 高速逆流色谱纯化他克莫司工艺放大研究[J]. 中国抗生素杂志， 2014，39（4）： 267-271.

王传喜， 乐占线， 陈宇翔， 等. 他克莫司互变异构体的制备及其结构鉴定[C]. 第十二届全国抗生素学术会议论文集. 成都： 中国药学会抗生素专业委员会、《中国抗生素杂志》杂志社、《中国医药生物技术》杂志社， 2013： 274-278.

顾觉奋. 分离纯化工艺原理[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 1994： 117-123.

王英豪， 邱颂平， 刘清华. 大孔吸附树脂对山茱萸总黄酮的分离纯化研究[J].中药与临床， 2012， 3（1）： 18-26.

何建勇. 生物制药工艺学[M]. 北京： 人民卫生出版社， 2007： 318-319.

Cabri W， Paissoni P， Roletto J， et al. Process for the purification of tacrolimus： USA， 20080160586[P]. 2008-07-03.

Choi BT， Ham YB， Yu SS， et al. Method for refining of high purity of tacrolimus： USA， 8362238[P]. 2013-01-29.

（收稿日期：2013-04-15）

浓缩和沉淀

收集合并大于1.0 mg/ml解吸液，减压、60 ℃浓缩至有白色固体粉末析出、浓缩液变清，移入5 ℃冰箱中放置1 d过滤，所得粉末按上述HPLC检测方法测FK506含量。

结果与讨论

树脂吸附容量

试验了4种不同树脂静态吸附提取液中FK506的效果（表1），按下式计算树脂饱和吸附量[6]：饱和吸附量（mg/g）=（样品溶液中FK506总量-吸附后残余的FK506总量）/树脂质量。

从表1可见，HZ816树脂比其它几种树脂吸附容量大，这是由于树脂孔径、比表面积、孔容及极性的不同导致吸附的能力的差异，而选用的HZ816树脂有较大的比表面积及适合的孔径；同时，加丙酮增加萃取脱色浓缩液的流动性及加适量水增大极性和减小溶解度，有利树脂吸附FK506。

吸附等温曲线

HZ816树脂在浓度不同的FK506溶液中对FK506进行吸附，其吸附等温线试验结果见图1。

从图1可见，该等温吸附曲线与Langmugir方程[7]吻合。树脂吸附量随溶液中FK506浓度提高而变大，当浓度提高到50 mg/ml以上时，其吸附容量提高幅度变小，而溶液黏度却增大，考虑到萃取脱色浓缩液效价浓度在75 mg/ml时，上柱吸附流速极小，因此对萃取脱色浓缩液需加溶剂丙酮增加萃取脱色浓缩液的流动性，但要控制FK506溶液浓度在最佳吸附效价。综上实验分析得出，可采用50 mg/ml浓度作为最佳吸附效价。

解吸

HZ816树脂解吸实验结果见表2。

从表2实验数据可见，前2个流分可分离去除大量色素等杂质，提高了洗脱流分的纯度，并且洗脱液单位集中，合并所收集的3～8解吸流分共1 301 ml，效价3.520 mg/ml，解吸收率达92.1 %。由于解吸流速小，有利交换洗脱，提高解吸液单位，故本实验采用1/100（v/v·min）流速解吸。对选用的解吸溶剂必须能使大孔吸附树脂溶胀，减少溶质与树脂间吸附力，同时使吸附物容易溶解，故本实验采用丙酮-纯水（3∶7）的混合溶剂洗脱，可去掉部分极性大的杂质，然后用70%丙酮水溶剂解吸附的FK506。

解吸液的质量考察

收集的解吸液于60 ℃减压浓缩至有白色固体粉末析出、浓缩液变清，移入5 ℃冰箱中放置1 d，抽滤，获得白色粉末，按上述HPLC检测方法测FK506重量含量为60.1%，折干含量（即粉末干燥除去水分后的重量含量）：81.3%，组分（即FK506归一含量）：达到91%左右，显著提高了中间体（图2）质量。中间体经精制可得高纯度FK506成品（图3），可见，采用HZ816树脂吸附分离杂质，对后续精制工艺非常有利。

解吸液于60 ℃减压浓缩过程中，随着浓缩液中丙酮量的减少，相对含水量增大，FK506在浓缩液中溶解度降低，有固体粉末析出，至浓缩液变清时，FK506已基本析出，移入5 ℃冰箱中放置1 d，随着温度降低溶液中的FK506不断析出，使固体粉末变粗，从而有利后续的抽滤并提高收率。

讨论

HZ816树脂可分离去除FK506萃取脱色浓缩液中的油脂、色素等杂质，比相关美国专利报道采用硅胶等一些分离介质效果好，工艺操作简便[8]。通过HZ816树脂分离所得FK506白色（或类白色）固体粉末，经精制可得高纯度FK506。产品质量达到国内外药典质量要求，可与美国专利报道的质量媲美[9]。采用HZ816树脂取代硅胶分离介质不仅收率高，而且树脂可再生重复使用，有益环保。

参考文献

张炜. 新型免疫抑制剂FK506[J]. 临床皮肤科杂志， 1995， 24（1）： 47.

周吉海， 谭季春. FK506 的发现和开发应用[J]. 日本医学介绍， 1994， 15（6）： 267-268.

温耀明， 肖丽华， 庄鸿， 等. 高速逆流色谱纯化他克莫司工艺放大研究[J]. 中国抗生素杂志， 2014，39（4）： 267-271.

王传喜， 乐占线， 陈宇翔， 等. 他克莫司互变异构体的制备及其结构鉴定[C]. 第十二届全国抗生素学术会议论文集. 成都： 中国药学会抗生素专业委员会、《中国抗生素杂志》杂志社、《中国医药生物技术》杂志社， 2013： 274-278.

顾觉奋. 分离纯化工艺原理[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 1994： 117-123.

王英豪， 邱颂平， 刘清华. 大孔吸附树脂对山茱萸总黄酮的分离纯化研究[J].中药与临床， 2012， 3（1）： 18-26.

何建勇. 生物制药工艺学[M]. 北京： 人民卫生出版社， 2007： 318-319.

Cabri W， Paissoni P， Roletto J， et al. Process for the purification of tacrolimus： USA， 20080160586[P]. 2008-07-03.

Choi BT， Ham YB， Yu SS， et al. Method for refining of high purity of tacrolimus： USA， 8362238[P]. 2013-01-29.

（收稿日期：2013-04-15）

浓缩和沉淀

收集合并大于1.0 mg/ml解吸液，减压、60 ℃浓缩至有白色固体粉末析出、浓缩液变清，移入5 ℃冰箱中放置1 d过滤，所得粉末按上述HPLC检测方法测FK506含量。

结果与讨论

树脂吸附容量

试验了4种不同树脂静态吸附提取液中FK506的效果（表1），按下式计算树脂饱和吸附量[6]：饱和吸附量（mg/g）=（样品溶液中FK506总量-吸附后残余的FK506总量）/树脂质量。

从表1可见，HZ816树脂比其它几种树脂吸附容量大，这是由于树脂孔径、比表面积、孔容及极性的不同导致吸附的能力的差异，而选用的HZ816树脂有较大的比表面积及适合的孔径；同时，加丙酮增加萃取脱色浓缩液的流动性及加适量水增大极性和减小溶解度，有利树脂吸附FK506。

吸附等温曲线

HZ816树脂在浓度不同的FK506溶液中对FK506进行吸附，其吸附等温线试验结果见图1。

从图1可见，该等温吸附曲线与Langmugir方程[7]吻合。树脂吸附量随溶液中FK506浓度提高而变大，当浓度提高到50 mg/ml以上时，其吸附容量提高幅度变小，而溶液黏度却增大，考虑到萃取脱色浓缩液效价浓度在75 mg/ml时，上柱吸附流速极小，因此对萃取脱色浓缩液需加溶剂丙酮增加萃取脱色浓缩液的流动性，但要控制FK506溶液浓度在最佳吸附效价。综上实验分析得出，可采用50 mg/ml浓度作为最佳吸附效价。

解吸

HZ816树脂解吸实验结果见表2。

从表2实验数据可见，前2个流分可分离去除大量色素等杂质，提高了洗脱流分的纯度，并且洗脱液单位集中，合并所收集的3～8解吸流分共1 301 ml，效价3.520 mg/ml，解吸收率达92.1 %。由于解吸流速小，有利交换洗脱，提高解吸液单位，故本实验采用1/100（v/v·min）流速解吸。对选用的解吸溶剂必须能使大孔吸附树脂溶胀，减少溶质与树脂间吸附力，同时使吸附物容易溶解，故本实验采用丙酮-纯水（3∶7）的混合溶剂洗脱，可去掉部分极性大的杂质，然后用70%丙酮水溶剂解吸附的FK506。

解吸液的质量考察

收集的解吸液于60 ℃减压浓缩至有白色固体粉末析出、浓缩液变清，移入5 ℃冰箱中放置1 d，抽滤，获得白色粉末，按上述HPLC检测方法测FK506重量含量为60.1%，折干含量（即粉末干燥除去水分后的重量含量）：81.3%，组分（即FK506归一含量）：达到91%左右，显著提高了中间体（图2）质量。中间体经精制可得高纯度FK506成品（图3），可见，采用HZ816树脂吸附分离杂质，对后续精制工艺非常有利。

解吸液于60 ℃减压浓缩过程中，随着浓缩液中丙酮量的减少，相对含水量增大，FK506在浓缩液中溶解度降低，有固体粉末析出，至浓缩液变清时，FK506已基本析出，移入5 ℃冰箱中放置1 d，随着温度降低溶液中的FK506不断析出，使固体粉末变粗，从而有利后续的抽滤并提高收率。

讨论

HZ816树脂可分离去除FK506萃取脱色浓缩液中的油脂、色素等杂质，比相关美国专利报道采用硅胶等一些分离介质效果好，工艺操作简便[8]。通过HZ816树脂分离所得FK506白色（或类白色）固体粉末，经精制可得高纯度FK506。产品质量达到国内外药典质量要求，可与美国专利报道的质量媲美[9]。采用HZ816树脂取代硅胶分离介质不仅收率高，而且树脂可再生重复使用，有益环保。

参考文献

张炜. 新型免疫抑制剂FK506[J]. 临床皮肤科杂志， 1995， 24（1）： 47.

周吉海， 谭季春. FK506 的发现和开发应用[J]. 日本医学介绍， 1994， 15（6）： 267-268.

温耀明， 肖丽华， 庄鸿， 等. 高速逆流色谱纯化他克莫司工艺放大研究[J]. 中国抗生素杂志， 2014，39（4）： 267-271.

王传喜， 乐占线， 陈宇翔， 等. 他克莫司互变异构体的制备及其结构鉴定[C]. 第十二届全国抗生素学术会议论文集. 成都： 中国药学会抗生素专业委员会、《中国抗生素杂志》杂志社、《中国医药生物技术》杂志社， 2013： 274-278.

顾觉奋. 分离纯化工艺原理[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 1994： 117-123.

王英豪， 邱颂平， 刘清华. 大孔吸附树脂对山茱萸总黄酮的分离纯化研究[J].中药与临床， 2012， 3（1）： 18-26.

何建勇. 生物制药工艺学[M]. 北京： 人民卫生出版社， 2007： 318-319.

Cabri W， Paissoni P， Roletto J， et al. Process for the purification of tacrolimus： USA， 20080160586[P]. 2008-07-03.

Choi BT， Ham YB， Yu SS， et al. Method for refining of high purity of tacrolimus： USA， 8362238[P]. 2013-01-29.

（收稿日期：2013-04-15）