药疹患者人类疱疹病毒7型感染的检测

张洋 陈官芝 朱桂芝 汤占利 陈宏泉 郭小燕

药疹患者人类疱疹病毒7型感染的检测

张洋 陈官芝 朱桂芝 汤占利 陈宏泉 郭小燕

目的探讨人类疱疹病毒7型(HHV-7)感染在药疹发病中的作用。方法收集50例药疹患者(其中重型药疹15例)及50例健康人外周血,采用PCR检测外周血单一核细胞中HHV-7 DNA特异性片段;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清HHV-7 IgM水平。结果50例药疹患者HHV-7 DNA阳性率(82.00%,41例)高于健康对照组(62.00%,31例),两组差异有统计学意义(χ2=4.96,P＜0.05);重型药疹患者(93.33%,14/15)、轻型药疹患者(77.14%,27/35)及健康对照组HHV-7 DNA阳性率差异有统计学意义(χ2=6.32,P＜0.05),其中重型组高于对照组(q=3.50,P＜0.05);重型药疹患者急性期与恢复期HHV-7 DNA阳性率差异无统计学意义(P＞0.05)。药疹患者HHV-7 IgM水平(69.3190±25.2897 ng/L)高于健康对照组(59.7853±22.4382 ng/L,t=1.99,P＜0.05);轻型药疹(65.4791±21.3261 ng/L)、重型药疹(74.3407±31.4112 ng/L)及健康对照组间差异均无统计学意义(均P＞0.05)。HHV-7 DNA阳性与阴性药疹患者HHV-7特异性IgM水平(分别为63.7481±27.2391 ng/L、65.5802±36.2584 ng/L)差异无统计学意义(P＞0.05)。结论药疹患者中存在HHV-7活动性感染,HHV-7感染可能是药疹发病或加重的因素。

药疹;疱疹病毒7型,人

作者单位:266000青岛大学医学院附属医院皮肤科(张洋、陈官芝、汤占利、陈宏泉);青岛市中心医院皮肤科(朱桂芝);菏泽市郓城县人民医院(郭小燕)

药疹是药物进入人体后引起的皮肤、黏膜反应。感染等环境因素可直接影响机体对药物的反应或通过修饰药物相关抗原使其具有免疫原性,在药疹的发病中有着重要意义[1]。近年来药疹的病毒感染因素受到高度重视。活动性病毒感染可改变机体的免疫调节功能,提高免疫系统的敏感性[2]。有学者发现,在药物超敏反应综合征(DIHS)患者中可以观察到人类疱疹病毒(HHV)的相继激活增殖[3]。我们的前期研究结果表明,EB病毒和HHV-6感染与药疹的发生相关[4-5]。本研究采用PCR技术检测外周血单一核细胞中HHV-7 DNA特异性片段,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清HHV-7特异性IgM水平,探讨HHV-7感染在药疹发生中的作用。

材料与方法

1.临床资料:50例药疹患者作为药疹组,均来自2011年9月至2013年3月青岛大学医学院附属医院皮肤科住院病例,其中女27例,男23例,年龄14～70(42.17±16.52)岁。所有患者均有明确的服药史,在服药后2 h至21 d(平均4.73 d)出现皮疹,符合药疹的诊断和分型标准[1]。其中重型药疹15例,包括DIHS 1例、Steven-Johnson综合征5例、大疱性表皮松解型药疹7例、剥脱性皮炎2例;轻型药疹35例,包括固定型4例、麻疹型或猩红热型17例、荨麻疹型9例、多形红斑型5例。致敏药物包括:青霉素或头孢类抗生素17例,占34.00%;磺胺类5例,占10.00%;解热镇痛药11例,占22.00%;抗癫痫药6例,占12.00%;别嘌醇2例,占4.00%;中药或中成药9例,占18.00%。选择同期健康体检者50例作为健康对照组,其中男、女各25例,年龄16～67(42.53±14.25)岁。两组性别和年龄差异均无统计学意义。本研究通过青岛大学医学院附属医院伦理委员会批准,所有受试对象均签署知情同意书。

2.标本制备:采集药疹患者急性期(发疹2～7 d)与健康对照晨起空腹静脉血3 ml,EDTA抗凝,提取外周血单一核细胞DNA,操作方法按试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)说明书进行,-20℃保存备用;同时采集药疹患者与健康对照晨起空腹静脉血3 ml,分离血清,-80℃保存用于ELISA。发疹10～15 d后(恢复期),15例重型药疹患者第2次采抗凝血提取DNA,方法同前。

3.PCR检测外周血单一核细胞中HHV-7 DNA:参照文献[6]设计HHV-7特异性引物,引物由美国Life Technologies公司合成,HHV-7上游引物序列:5'-CCCAACTATTTACAGTAGGGTTGGTG-3',下游引物序列:5'-TTTAGTTCCAGCACTGCAAT CG-3',扩增产物124 bp。反应体系为25 μl,含2×HotMaster PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)12.5 μl,上下游引物各 1 μl,模板 2 μl,ddH2O 8.5 μl。反应条件为95℃预变性5min;然后95℃10 s,60℃30 s,共35个循环;最后72℃延伸5min。每份标本均做3次生物学重复实验,每次实验设阳性对照、阴性对照及空白对照。阳性对照和阴性对照DNA分别来自HHV-7标准株感染的阳性和阴性SUPT-1淋巴细胞标准株,由南京医科大学姚堃教授惠赠,空白对照用ddH2O替换模板DNA。反应结束后取PCR产物于2.5%琼脂糖凝胶电泳(120 V,40min),凝胶成像系统观察电泳结果。

4.ELISA法检测血清HHV-7特异性IgM水平:试剂盒为美国BD公司产品,具体方法参照试剂盒说明书进行,每份标本均做3个复孔。

5.统计学方法:采用SPSS19.0软件进行统计处理,定量检测结果以±s表示,2组间均数比较采用t检验,3组间均数比较采用单因素方差分析,定性数据用率表示,组间率的比较采用χ2检验,组间的多重比较采用q检验。

结 果

1.HHV-7 DNA检测结果:50例药疹患者中41例HHV-7 DNA阳性,阳性率82.00%,健康对照组31例阳性,阳性率62.00%,两组阳性率差异有统计学意义(χ2=4.96,P＜0.05)。重型药疹组15例中14例阳性(93.33%),轻型药疹组35例中27例阳性(77.14%),健康对照组阳性率62.00%,3组阳性率差异有统计学意义(χ2=6.32,P＜0.05),其中重型药疹组高于对照组(q=3.50,P＜0.05)。重型药疹组患者急性期HHV-7 DNA阳性率高于恢复期(73.33%,11/15),但差异无统计学意义(P＞0.05)。HHV-7 DNA特异性片段扩增产物长度124 bp,部分标本电泳结果见图1。

图1 HHV-7 DNA扩增产物电泳图1:标准参照物;2～5:目的基因

2.HHV-7特异性IgM抗体检测结果:药疹患者组HHV-7特异性IgM抗体水平(69.3190±25.2897ng/L)高于健康对照组(59.785 3±22.438 2 ng/L),两组差异有统计学意义(t=1.99,P＜0.05);重型药疹组(74.340 7±31.411 2 ng/L)、轻型药疹组(65.479 1±21.326 1 ng/L)及健康对照组HHV-7 IgM抗体水平依次递减,经单因素方差分析,组间差异无统计学意义(F=2.32,均P＞0.05)。

3.HHV-7 DNA阳性与阴性药疹患者HHV-7特异性IgM抗体检测:HHV-7 DNA阳性的41例药疹患者HHV-7特异性IgM抗体水平(63.748 1±27.239 1 ng/L)与HHV-7 DNA阴性的9例药疹患者(65.580 2±36.258 4 ng/L)相比,差异无统计学意义(t=0.17,P＞0.05)。

讨 论

药疹的发病机制复杂,对抗生素过敏多发生在治疗某种疾病时应用抗生素,很少发生于应用抗生素预防某些疾病的健康人中。感染等环境因素可直接影响机体对治疗药物的反应或改变药物有关抗原变为免疫原性,其在药疹的发病中有重要意义[1]。有报道药疹的发生与病毒感染有关,特别是人类疱疹病毒和HIV[4]。这些病毒在体内可互相联系,一种病毒的激活复制可导致其他病毒的激活复制[7]。LeClaire等[8]报道的传染性单核细胞增多症患者使用氨苄西林等抗生素治疗,常导致全身性麻疹样皮疹,当急性期消退后再用这些药物治疗,皮疹不复发。Kano等[3]研究发现,DIHS患者的症状于停用原因药物之后仍持续发展并转为迁延化,原因除了特定的药物及遗传因素之外,此类患者体内存在潜伏感染病毒的再激活,主要是人疱疹病毒。Eliaszewicz等[9]发现,HIV感染者药物反应的发生率比健康人要高,尤其在艾滋病中,严重的药物反应例如,Steven-Johnson综合征和中毒性表皮坏死松懈症与正常人相比大幅度增加。

本研究结果显示,药疹患者组HHV-7 DNA阳性率高于健康对照组;与健康对照比较,HHV-7 DNA阳性率有随药疹病情加重升高趋势,且重型药疹患者恢复期HHV-7 DNA阳性率较急性期有下降趋势,提示HHV-7感染可能与药疹有关,HHV-7可能为导致药疹发病或加重的一个危险因素。

药疹患者血清中病毒特异性抗体的测定作为研究病毒与药疹关系的有效手段已被国外学者广泛应用,HHV-7特异性IgM抗体的出现提示活动性HHV-7感染。本研究结果显示,药疹患者组与健康对照组IgM水平有差异,提示药疹患者可能存在新近或活动性HHV-7感染。

本研究中,HHV-7 DNA阳性药疹患者HHV-7特异性IgM抗体水平与HHV-7 DNA阴性药疹患者相比,差异无统计学意义,提示外周血单一核细胞HHV-7 DNA与机体免疫系统对HHV-7编码产物产生IgM抗体之间并不一定是平行的关系,推测可能有以下原因:①病毒由潜伏状态转为活动性感染,造成机体免疫功能紊乱;②HHV-7在淋巴细胞中主要是以潜伏感染的形式存在,随着淋巴细胞的有丝分裂而复制,病毒拷贝数增加的同时不编码产生HHV-7溶解性抗原,也就不引起机体的抗体反应,从而逃避了细胞毒性T细胞的识别和杀伤;③游离的HHV-7一旦释放入血很容易被机体细胞免疫系统识别和清除,因此在血清中存在的时间可能很短,而HHV-7抗原引起的抗体反应需要一定的时间才能发生,所以两者不能完全同步出现;④本研究多数患者一般在发疹2～7 d采集标本,此时HHV-7特异性IgM的抗体效价较低。

本研究结果提示,药疹患者中存在HHV-7的活动性感染和DNA阳性率增加,HHV-7感染可能是影响药疹发病及加重的环境因素之一。HHV-7感染与药疹致敏药物及严重程度的关系、各型疱疹病毒感染在药疹患者所占地位等诸多问题,可能需要定量PCR、动物实验及临床试验进一步研究。

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2013-09-30)

(本文编辑:颜艳)

Detection of human herpesvirus type 7 infection in patients with drug eruptions

Zhang Yang*,Chen Guanzhi,Zhu Guizhi,Tang Zhanli,Chen Hongquan,Guo Xiaoyan.*Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Medical College,Qingdao University,Qingdao 266000,China

Chen Guanzhi,Email:chenguanzhi@outlook.com

ObjectiveTo investigate the role of human herpesvirus type 7(HHV-7)in the development of drug eruptions.MethodsVenous blood samples were collected from 35 patients with mild drug eruptions at acute stage,15 patients with severe drug eruptions at both acute stage and remission stage,as well as 50 healthy human controls.PCR was performed to detect HHV-7 DNA in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs),and enzymelinked immunosorbent assay(ELISA)to determine the titer of anti-HHV-7 IgM antibody in serum.Statistical analysis was carried out byttest,one way analysis of variance,Chi-square test andqtest.ResultsThe detection rate of HHV-7 DNA was significantly higher in these patients with drug eruptions than in the healthy controls(82.00%(41/50)vs.62.00%(31/50),χ2=4.96,P＜ 0.05),different among patients with severe drug eruptions(93.33%(14/15)),patients with mild drug eruptions(77.14%(27/35))and the healthy controls(χ2=6.32,P＜0.05),higher in the patients with severe drug eruptions than in the healthy controls(q=3.50,P＜0.05),but not significantly different between the patients with severe drug eruptions at acute stage and those at remission stage(73.33%(11/15),P＞0.05).The anti-HHV-7 IgM antibody titer was significantly increased in the patients with drug eruptions compared with the healthy controls((69.319 0±25.289 7)ng/L vs.(59.785 3±22.438 2)ng/L,t=1.99,P＜0.05),but no significant difference was observed among the patients with severe drug eruptions(74.340 7±31.411 2)ng/L),patients with mild drug eruptions((65.479 1±21.326 1)ng/L)and healthy controls(P＞0.05)or between HHV-7 DNA-positive patients((63.748 1±27.239 1)ng/L)and-negative patients((65.580 2±36.258 4)ng/L,P＞0.05).ConclusionsActive HHV-7 infection exists in patients with drug eruptions,and may be associated with the development and aggravation of this entity.

Drug eruptions;Herpesvirus 7,human

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.006

陈官芝,Email:chenguanzhi@outlook.com