防感煎剂对H1N1病毒感染小鼠TNF-α、IL-6的影响*

徐一凯，杨珺超

（1.浙江中医药大学，浙江杭州 310053；2.浙江中医药大学附属第一医院，浙江杭州 310006）

防感煎剂系浙江省中医院国家级名老中医的经验方，主要由荆芥10g，防风10g，前胡10g，板蓝根 10g，大青叶 10g，黄芩 10g，杏仁 10g，白芷 10g，陈皮6g组成。方中诸药寒温并用，功能解表散寒、清热解毒、宣肺利气，经长期临床使用证实：该药有较好的防治流感效果。前期的实验结果显示防感煎剂有很好的直接抑制甲1型流感病毒作用以及调节T细胞免疫功能作用[1]，可以减轻肺部炎症损害，有利于病毒感染的控制；体外抑制试验的研究结果表明防感煎剂可以阻止病毒吸附于易感细胞[2]。本实验从小鼠TNF-α和IL-6细胞因子的表达入手，进一步揭示防感煎剂抗病毒感染的免疫机理。

1 实验材料

1.1 实验动物

清洁级ICR小鼠（二级）96只，雌雄各半，体质量（20±2）g，购于浙江中医药大学实验动物中心。

1.2 实验药品

防感煎剂所需中药购自浙江中医药大学附属第一医院中药房，药物品系和质量合格。药材鉴定人：钱松洋，主任中药师。按常规方法煎煮2次，将前后两次煮液合并，过滤，所得滤液进行浓缩，最终使用药物剂量为29.32g/kg（经前期实验验证为最佳药物浓度）[1]。实验使用药物剂量为29.32g/kg。磷酸奥司他韦（达菲）胶囊，75mg/粒，批号 E1284，罗氏大药厂香港有限公司。

1.3 病毒

甲1型流感病毒鼠肺适应株（FM1），由浙江省疾病预防与控制中心病毒所提供。经测定，该病毒对小鼠的 LD50为 10-4/20μl。

1.4 实验试剂

小鼠肿瘤坏死因素（TNF-α）ELISA试剂盒，批号 1207283；小鼠白介素-6（IL-6）ELISA 试剂盒，批号1207281均由美国R&D公司分装，上海西唐生物科技有限公司提供。

1.5 统计方法

采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素 ANOVA，组间两两比较，方差齐性时用LSD-t检验，方差不齐时用Tamhane's T2检验，P＜0.05为有统计学差异。

2 实验方法

2.1 分组及用药情况

小鼠按体重分层随机分为正常对照组、模型对照组、防感煎剂组、达菲对照组，每组24只。按照体型系数换算法进行实验动物与人用药量的换算，防感煎剂组给药量剂量为29.32g/kg；达菲对照组给药剂量为0.02g/kg，正常对照组和模型组以生理盐水灌胃，每天1次，每次0.25mL/10g，分别灌胃给药，先正常给药2d，第3-8天在甲1型流感病毒液滴鼻感染造模后2h灌胃给药，共给药8d。

2.2 造模方法

给药第3天，小鼠用乙醚轻度麻醉后，正常对照组以生理盐水滴鼻，其余各组以10LD50的甲1型流感病毒液滴鼻感染，每只20μL，以滴鼻造模的次日为病毒感染后第1天，每组小鼠分别于感染后第1，5，9，13 天随机取小鼠动态观察毛色，皮肤，反应速度（对一般刺激）等情况。

3 结果

3.1 小鼠一般情况的变化

正常组小鼠毛色光洁，呼吸平稳，活泼好动，反应灵敏，饮食正常，而病毒感染的72只小鼠不久即出现不同程度的形体消瘦，毛色干枯，反应迟钝。各药物干预组随着药物的应用，症状明显较模型组减轻。模型组形体消瘦，毛色枯槁，精神萎靡、反应迟钝，饮食减少。达菲组较模型组、防感煎剂组毛色稍润泽，反应稍灵敏。

3.2 RT-PCR检测感染小鼠流感病毒含量

实时荧光定量RT-PCR检测流感病毒含量结果显示：第1天，第5天，防感煎剂组病毒含量低于模型对照组（P＜0.05）；第9天防感煎剂的病毒含量低于模型对照组，但没有统计学上的差异（P＞0.05）；第13天防感煎剂组病毒含量低于模型对照组（P＜0.05或P＜0.01）。从表6中可以看出，感染后第5天病毒含量达到峰值，第9天起不再继续增高，而经防感煎剂处理后，病毒高峰仍在第5天出现，但无论是病毒感染初期，中期及后期病毒含量都明显下降。见表1

表1 病毒含量 （单位：copies/μl）

3.3 血清中细胞因子的表达

3.3.1 血清TNF-α因子表达

感染后各组小鼠血清TNF-α随时间呈升高趋势。但在感染初期（第1天）和感染中期（第5天）各组之间TNF-α表达无明显差异。感染后期（第9天、第13天）时模型对照组TNF-α明显高于正常对照组（P＜0.01），防感煎剂组和达菲对照组明显低于模型对照组（P＜0.05，P＜0.01），但两组之间比较无统计学差异（P＞0.05），与正常对照组比较也无统计学差异（P＞0.05）。提示：病毒感染后期TNF-α表达增加，防感煎剂能抑制TNF-α的表达。见表2

表2 血清TNF-α表达 （单位：pg/mL）

3.3.2 血清IL-6因子表达

感染后各组小鼠血清IL-6随时间呈升高趋势。但在感染初期（第1天）和感染中期（第5天）各组之间IL-6表达无明显差异。感染后期（第9天、第13天）时模型对照组IL-6明显高于正常对照组（P＜0.01），防感煎剂组和达菲对照组明显低于模型对照组（P＜0.05，P＜0.01），但两组之间比较无统计学差异（P＞0.05），与正常对照组比较也无统计学差异（P＞0.05）。提示：病毒感染后期IL-6表达增加，防感煎剂能抑制IL-6的表达。见表3。

表3 血清IL-6表达 （单位：pg/mL）

4 讨论

流感是由流行性流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流感病毒发病率高、传染性强、致死率高，其中甲型流感病毒的抗原变异性最大，曾3次导致世界性大流行的流感[3]。其中感染人类并能够引起一定范围流行的甲型流感病毒包括甲1（H1N1）和甲3（H3N2）型[4]。病毒感染机体后，可启动宿主免疫应答，形成炎症反应和炎症免疫病理损伤。在免疫病理损伤过程中，涉及多种免疫细胞和细胞因子，而中医药在调节机体和细胞免疫方面有明显的优势，现代的中药研究显示[5]，有些中药可直接灭活或抑制病毒，有些中药则通过诱生干扰素或调节人体免疫功能而发挥间接抗病毒作用。而复方中药，其有效成分多，能从多环节调节机体的细胞免疫，因而能为病毒感染过程中引起炎症免疫病理性损伤的治疗提供新的研究思路。

研究发现激活的巨噬细胞，能增强促炎性细胞因子的分泌，包括IL-6和TNF-α[6-7]。而IL-6，TNF-α等炎性细胞因子通过趋化、活化淋巴细胞、中性粒细胞等，产生免疫病理损伤；另一方面，这些细胞因子可直接作用于细胞、微血管等，造成组织损伤[8]。实验结果表明防感煎剂能明显改善小鼠一般状况，降低小鼠肺组织中H1N1病毒含量，抑制TNF-α、IL-6等炎性细胞因子的表达，并且与达菲组比较效果相当。说明防感煎剂可抑制H1NI病毒复制，在病毒感染引起的免疫病理损伤过程中发挥作用，通过抑制细胞因子TNF-α、IL-6的表达，从而减轻由炎性介质过度释放引起的免疫病理损伤，从而来控制感染、改善症状。

[1]汪玉冠，宋康，骆仙芳，等.防感煎剂对甲1型流感病毒感染小鼠T细胞亚群及活化的影响 [J].中国中医药科技，2012，19（1）：22-24.

[2]宋康.防感煎剂含药血清体外抑制甲1型流感病毒作用的实验研究[C].第十次全国中西医结合防治呼吸系统疾病学术研讨会，2009.

[3]Carolien E.van de Sandt，Joost H.C.M.Kreijtz，Guus F.Rimmelzwaan.Evasion of Influenza A viruses from Innate and Adaptive Immune Responses[J].Viruses，2012 September，4（9）：1438-1476.

[4]WHO.Influenza（seasonal）fact sheet N°211.[EB/OL].[2009 April].http：//www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/index.html.

[5]黄海英，宋辉.抗流感病毒中药研究进展[J].实用中医药杂志，2012，28（5）：439-440.

[6]van Riel D. ，Leijten L.M.，van der Eerden M.Highly pathogenic avian influenza virus H5N1 infects alveolar macrophages without virus production or excessive TNF-alpha induction[J].PLoSPathog，2011，7：e1002099.

[7]Becker S.，Quay J.，Soukup J.Cytokine（tumor necrosis factor，IL-6，and IL-8）production by respiratory syncytial virus-infected human alveolar macrophage[J].Immunol，1991，147：4307-4312.

[8]Campbell D.J.，Koch M.A.Phenotypical and functional specialization of FOXP3+regulatory T cells[J].Nat.Rev，2011（11）：119-130.