低氧可诱导蛋白2作为新肾癌肿瘤标志物的临床应用

杨 斌 张 争 毛泽斌 辛殿祺 (北京大学第一医院泌尿外科，北京 00034)

肾细胞癌(RCC)早期缺乏典型的临床表现，约30%的患者在确诊时已经发现有远处转移。RCC生物学行为极为复杂，对放疗化疗均不敏感〔1，2〕。大部分靶向治疗药物仍处于临床试验阶段，并且普遍存在完全缓解率低的问题〔3〕。目前尚缺乏一个RCC的肿瘤标志物用于临床诊断。Togashi等〔4〕通过cDNA微列阵分析，选出RCC患者中普遍且明显过表达的基因。并通过半定量RT-PCR、免疫组织化学分析等实验方法，最终证实低氧可诱导蛋白2(HIG2)蛋白的表达在RCC组织中明显上调，而未在其他正常的器官组织内检测到其上调。本文分析HIG2蛋白在RCC临床诊断上的作用。

1 材料和方法

1.1 研究对象 收集2012年10月至2013年12月北大医院泌尿外科100例RCC患者的新鲜血液，其中男56例，年龄60～86〔平均(71.35±1.33)〕岁;女 44例，年龄 60～76〔平均(68.57±2.18)〕岁;与100名健康志愿者的新鲜血液，其中男46例，年龄24～38岁;女54例，年龄23～35岁，平均年龄28岁。患者与志愿者均已知情，并通过伦理审查。采集的血液均经水平离心机4℃，3 000 r/min离心15 min。提取上清血清后，再经小型离心机4℃，12 000 r/min离心10 min提取血清，并保存于－80℃以待检测。

1.2 试剂和材料 大肠杆菌融合表达载体pGEX4T-3 Vector购于Pharmacia Biotech公司，在EcoRI和XhoI位点间插入扩增的HIG2编码区并经测序验证。该HIG2/pGEX4T-3质粒由北京大学基础医学院生化系王秀娟提供。大肠杆菌BL21购于天根生化科技有限公司;96孔单条可拆酶标板购于美国康宁公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购于美国Thermo公司;HIG2鼠源单克隆抗体购于上海Santa Cruz公司;HIG2兔源多克隆抗体购于英国Abcam公司;酶联免疫反应板包被液购于美国SurModics公司;TMB单组分显色液购于北京索莱宝科技有限公司。

1.3 谷胱基肽疏基转移酶(GST)-HIG2融合蛋白可溶性表达将测序正确的HIG2/pGEX4T-3质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑取单克隆分别接种含氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中，37℃、180 r/min震荡培养至 OD600=0.4～0.6，并加入IPTG诱导剂至终浓度1 mmol/L，继续培养4 h后，4℃、8 000 r/min离心10 min收集菌体。菌体沉淀用100 μl磷酸盐缓冲液(PBS)重悬后加等量的上样缓冲液，经100℃水浴5 min后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测融合蛋白的表达情况，鉴定表达产物。

1.4 GST-HIG2融合蛋白纯化 将HIG2/pGEX4T-3质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞后大量诱导，4℃、8 000 r/min离心10 min收集菌体，用1×PBS缓冲液重悬菌体。4℃条件下超声破碎菌体，超声后产物经4℃、5 000 r/min离心20 min，分别收集离心上清液和沉淀。对收集液分别进行SDS-PAGE检测。取超声后的上清液过GST亲和层析柱中，使柱中的上清液缓慢流穿。用10倍柱床体积的PBS冲洗。再用含GSH的洗脱液去除杂蛋白。收集流穿液和洗脱液，所有收集的液体均进行SDS-PAGE分析。纯化后的HIG2蛋白用2 000 ml的1×PBS透析以除去谷胱甘肽。最后采用BCA法测定HIG2蛋白浓度。

1.5 ELISA双抗体夹心法测定GST-HIG2表达水平 用酶联免疫反应板包被液，将HIG2单克隆抗体稀释至蛋白质浓度为2 μg/ml，4℃包被 96 孔酶标板 12 h;用 0.15 mol/L pH7.4 PBS洗涤缓冲液洗3次后加入5%脱脂奶粉37℃封闭1 h;1×PBS洗涤3次后，分别取倍比稀释的标准品HIG2蛋白以及稀释的健康志愿者和RCC患者的血清样品100 μl加入上述已包被好的反应孔中，37℃孵育1 h;1×PBS洗涤3次后，加入1∶1 000稀释的HIG2多克隆一抗37℃孵育1 h;PBS洗涤3次后，加入1∶1 000辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG 37℃孵育1 h;PBS洗涤3次后，加入TMB底物显色液100 μl，37℃避光显色15 min;加入 2 mol/L H2SO450 μl，终止反应后，于酶联免疫检测仪450 nm波长下读数。通过HIG2纯蛋白绘制浓度标准曲线，计算200例血清样品的浓度，并按照HIG2蛋白所占GSTHIG2蛋白的分子量比例以及血清稀释比例，换算成纯HIG2蛋白的浓度。浓度标准曲线的绘制采用了Curve Exert1.4软件。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0软件进行工作特征曲线(ROC)分析。

2 结果

2.1 GST-HIG2融合蛋白在大肠杆菌BL21中的表达 含重组质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后，在相对分子质量约31 kD位置出现了一条蛋白条带，该结果与预期GST-HIG2融合蛋白相对分子量为31 kD结果一致。见图1。

图1 融合蛋白经IPTG诱导后的表达

2.2 GST-HIG2融合蛋白的纯化 目的蛋白GST-HIG2主要存在上清液中，表明GST-HIG2融合蛋白主要以可溶性的形式存在。利用GST融合蛋白亲和层析柱进行目的蛋白纯化，SDSPAGE分析显示纯化的融合蛋白呈单一条带，纯度为86%。BCA法检测GST-HIG2融合蛋白浓度为0.42 mg/ml。见图2。

2.3 样品血清中HIG2蛋白浓度计算结果 经纯化后的GSTHIG2 融合蛋白分别按照 31、32、33、34、35、36、37 和 41、42、43、44、45、46、47进行稀释，用 ELISA方法检测得出相应 OD值，100例健康志愿者和100例RCC患者血清样品中HIG2蛋白浓度的中位数分别为1 μg/ml(四分位差为0.61～1.56 μg/ml);3.4 μg/ml(四分位差为 2.05 ～10.47 μg/ml)。

2.4 ROC曲线分析结果 对上述浓度值绘制ROC曲线，曲线下面积为0.870，95%置信区间为(0.821，0.918)，P ＜0.001，其诊断正确性为中等，cut-off值为2.03 μg/ml，敏感度和特异度分别为76%、85%，约登指数为61%。见图3。

图2 融合蛋白的表达和纯化

图3 ROC曲线对健康志愿者和肾癌患者血清浓度的分析

3 讨论

2009年全国范围内RCC新发病例数为4 916例，约占全部恶性肿瘤新发病例数的2.01%，在恶性肿瘤发病中排第12位〔1〕。根据RCC病理组织分型，最常见的病理组织类型为透明细胞癌约占80%〔5〕。RCC患者早期诊断主要依靠影像学检查，但很多直径＜1 cm的微小肿瘤仍然难以及时准确发现。穿刺活检可判断肿瘤的病理分级分型，但这是一项有创且与临床症状相关联的检查，存在着假阴性、不能及时及针孔肿瘤转移的可能。因此，目前尚缺乏RCC肿瘤标志物用于临床诊断。

HIG2蛋白作为低氧诱导基因首次被Denko等〔6〕发现，其cDNA全长包含1 372个核苷酸。Togashi等〔4〕通过cDNA微列阵分析，选出RCC患者中普遍且明显过表达的基因。并通过半定量RT-PCR、免疫组织化学分析等实验方法最终证实HIG2蛋白在RCC明显上调。通过小干扰RNA(siRNA)阻断HIG2蛋白表达后，RCC细胞生长明显受到了抑制;在肾癌细胞培养基中加入HIG2多克隆抗体，可明显诱导RCC细胞的凋亡〔4〕。以上结果均说明HIG2蛋白在RCC细胞生长中起着重要作用。

目前von Hippel-Lindau(VHL)基因通路被认为是肾透明细胞癌中主要诱发癌症的基因通路。肾透明细胞癌可普遍发现VHL基因甲基化或突变〔7〕，导致调控缺氧诱导因子(HIF)-1α的VHL基因失活，从而使HIF蛋白异常堆积，并进一步使一系列HIF下游调控基因如血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)-α等表达异常，最终导致细胞生理代谢紊乱诱发癌症〔8〕。如临床已经使用的Sorafenib就是通过阻断该通路的来治疗RCC的药物〔9〕。但这些药物往往会使其下游一系列调控蛋白受到抑制，影响多种器官的正常生理代谢，造成严重副作用〔10〕。与之相比，Denko等〔6〕证明在低氧条件下是由 HIF1 调节HIG2的表达，阻断该靶点通路不会影响HIF其他下游调控基因，这样就为临床的靶向治疗避免严重的副作用提供了基础。并且HIG2蛋白仅在RCC组织高表达。免疫染色显示HIG2蛋白在肝脏、心脏、肺、前列腺、骨髓以及正常成人肾脏组织均不表达或低表达。半定量逆转录-聚合酶链式反应显示HIG2 mRNA在其他器官肿瘤如直肠癌、乳腺癌、肝细胞癌等几乎检测不到〔4〕。因此，HIG2蛋白为筛选RCC临床诊断的肿瘤标志物以及分子药物治疗的靶标提供了理论依据。

1 张永贞，杨国庆，张思维，等.中国2009年肾及泌尿系统其他癌发病和死亡分析〔J〕.中国肿瘤，2013;22(5):333-7

2 Garcia JA，Rini BI.Recent progress in the management of advanced renal cell carcinoma〔J〕.CA Cancer J Clin，2007;57(2):112-5.

3 毕新刚，马建辉.肾癌靶向治疗现状〔J〕.临床药物治疗杂志，2011，9(1):16-20.

4 Togashi A，Katagiri T，Ashida S，et al.Hypoxia-inducible protein2(HIG2)，a novel diagnostic marker for renal cell carcinoma and potential target for molecular therapy〔J〕.Cancer Res，2005;65(11):4817-26.

5 Oya M，Murai M.Renal cell carcinoma:relevance of pathology〔J〕.Curr Opin Urol，2003;13(6):445-9.

6 Denko N，Schindler C，Koong A，et al.Epigenetic regulation of gene expression in cervical cancer cells by the tumor microenvironment〔J〕.Clin Cancer Res，2000;6(2):480-7.

7 Lessi F1，Mazzanti CM，Tomei S，et al.VHL and HIF-1α:gene variations and prognosis in early-stage clear cell renal cell carcinoma〔J〕.Med Oncol，2014;31(3):840

8 Patel PH，Chadalavada RS，Chaganti RS，et al.Targeting von Hippel-Lindau pathway in renal cell carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res，2006;12(24):7215-20.

9 Escudier B，Eisen T，Stadler WM，et al.Sorafenib in advanced clear-cell renal-cell carcinoma〔J〕.N Engl J Med，2007;356(2):125-34.

10 Mizutani Y.Recent advances in molecular targeted therapy for metastatic renal cell carcinoma〔J〕.Int J Urol，2009;16(5):444-8.