茶叶中β-樱草糖苷酶及其底物的研究进展

项丽慧，林馥茗，孙威江，2，*

(1.福建农林大学园艺学院，福建福州350002;2.福建农林大学安溪茶学院，福建泉州362400)

β-樱草糖苷酶(β-primeverosidase，6-O-β-D-xylopranosyl-β-D-glucopyranosides)，具有基团专一性，特异性水解β-樱草糖苷。对茶叶而言，其主要作用是通过水解萜醇类糖苷香气前体，使茶叶呈现出天然花香，并且在茶叶的防御机制中起到一定的积极效应。

早在 1925 年，Bridel M［1］在报春花 (Primula officinalis)上发现了β-樱草糖苷酶具有水解β-樱草糖苷的作用。之后，Guo W等［2］从茶树叶片中分离β-樱草糖苷酶，并提出该酶对红茶和乌龙茶香气有影响。在栀子花中，也有检测出β-樱草糖苷酶的活性［3］。在许多植物中，色素、药理成分等生理活性物质均以β-樱草糖苷的形式存在，如海巴戟天［4］、杜仲［5］、苹果［6］、白土茯苓［7］等植物。Plouvier［8］研究认为，β-樱草糖苷酶主要存在于含有β-樱草糖苷的高等植物体内。由于β-樱草糖苷在植物体内可稳定存在，越来越多的β-樱草糖苷被检出，可推断β-樱草糖苷酶在植物体中分布较为广泛，但由于在其他植物中β-樱草糖苷酶的功能不显著或突出，对β-樱草糖苷酶的研究暂局限于茶树和相关深加工行业。

在茶叶醇类糖苷水解途径［9］中，起到关键作用的糖苷类酶主要为β-樱草糖苷酶、β-葡萄糖苷酶以及β-半乳糖苷酶［10-11］，相比 β-樱草糖苷酶，其他酶的研究报道较多［12-16］。β-樱草糖苷酶对茶叶的香气机理、抗病防御体系、食品加工、化工、制药有着重要实际意义，因此本文对β-樱草糖苷酶酶学特性、提取纯化方法、活性测定方法、分子生物学及其底物种类和变化规律等方面进行综述，并探讨了今后β-樱草糖苷酶的应用前景。

1 β-樱草糖苷酶

β-樱草糖苷酶，分子量 61ku，等电点 9.4，当pH5～7、温度50℃以下时酶活性稳定，最适 pH为5.0，温度 50℃时活性最高［17］。

1.1 专一性

一般而言，糖苷酶对糖苷配基的特异性比对糖残基的特异性差，β-樱草糖苷酶也是如此，表现为基团专一性，对苷键与糖基的立体结构有很强的特异性。Guo W等［18］研究发现β-樱草糖苷酶对(S)-芳樟醇-β-樱草糖苷、苯甲醇-β-樱草糖苷、苯甲醇-6-O-β-D-呋喃芹菜糖基-β-D-葡萄吡喃糖苷水解活性很高，对(R)-芳樟醇-β-二糖苷、香叶醇-6-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基-β-二糖苷-D-葡萄吡喃糖苷水解活性低。Matsumura S［19］以银盐法合成的β-樱草糖苷、甾菜糖苷为底物研究了β-樱草糖苷酶的专一性，认为它对配糖体和糖基均具有严格的特异性。Ijima Y等［20］以从茶叶中提取的双糖苷为底物分别与β-樱草糖苷酶进行反应，结果发现β-樱草糖苷酶的底物专一性是对含有1-6糖苷键的樱草糖苷的相对专一性，这与 Matsumura S的观点不同。Wei-Wei Han等［21］利用β-葡萄糖苷酶的已知结构，构建了β-樱草糖苷酶的3D模型，并且找到了结合位点，发现只有β-樱草糖苷可与其对接。以上研究中，早期均是通过水解反应结果作为依据，判断β-樱草糖苷酶的专一性，而Wei-Wei Han从分子动力学角度印证了β-樱草糖苷酶的基团专一性。

1.2 底物

1.2.1 β-樱草糖苷的分布 β-樱草糖苷作为茶叶的重要香气前体物质，受到人们极大的关注。1993年，Guo W 等［22］证实香叶醇在茶叶中主要以香叶醇-β-D-樱草糖苷形式存在，芳樟醇主要以芳樟醇-β-D-樱草糖苷的形式存在，验证了茶树中不单有葡萄糖苷，还有β-樱草糖苷的存在。Wang D等［23］合成了26多种糖苷，采用三氟乙酰化衍生方法结合GC-MS对茶叶中的糖苷进行定性和定量的分析，发现茶叶中存在11种β-樱草糖苷和10种β-葡萄糖苷，并且鲜叶中β-樱草糖苷的含量是β-葡萄糖苷的3倍。近年，采用Amberlite XAD-2作为填料进行柱层析分离茶叶 β-樱草糖苷，Yano M 等［24-31］陆续分离了薮北种、毛蟹、水仙、槠叶种中的糖苷类香气前体，结合GC-MS技术，发现顺-3-己烯醇、芳樟醇及其氧化物(Ⅰ、Ⅱ)、香叶醇、水杨酸甲酯、苯甲醇和2-苯乙醇为茶叶中主要苷元，除了苯甲醇，其余均以β-樱草糖苷形式存在，只有顺-3-己烯醇和苯甲醇存在β-葡萄糖苷，这与Wang D等［23］的研究结果不同。由以上研究结果可看出，较β-葡萄糖苷而言，结合在β-樱草糖苷的苷元更多，说明β-樱草糖苷在茶树中是更为重要的前体物质。

1.2.2 在茶叶中的变化规律 对不同季节、不同加工过程的茶树鲜叶中糖苷类香气前体进行研究，发现各种前体在苷元组成上是一致［32-34］。张正竹等［32］研究发现，槠叶种春茶的香叶醇糖苷的含量很高，秋茶的芳香族醇和脂肪族醇糖苷含量明显增长，但单萜烯醇糖苷含量下降。由此可看出，鲜叶的糖苷类香气前体物质是成品茶香气的季节差异性成因之一。Wang D等［33］发现在红茶揉捻工序中 β-樱草糖苷明显减少，经发酵工序后几乎完全消失，而葡萄糖苷含量保持不变，说明β-樱草糖苷是红茶香气主要前体物质，但与红茶加工不同的是，在乌龙茶晒青过程中，大多数糖苷含量上升，成茶的糖苷达到最高水平［34］。这有可能是二者加工过程中环境温湿度以及工艺不同而导致，具体原因有待深入研究。

2 提取纯化及酶活测定方法

经提取纯化后，可获得较高纯度的β-樱草糖苷酶，使β-樱草糖苷酶具有最大的催化活性。Ogawa K等［35］将茶鲜叶经匀浆处理制成丙酮粉，用40%～80%的硫酸铵沉淀酶蛋白，经透析后，用CM-TOyopearl 650M柱层析，得到糖苷酶三个组分，其中Ⅱ组分组经膜超滤脱盐浓缩，再使用单SHR5/5离子交换柱进行快速蛋白液相色谱分离，得到Ⅱ1、Ⅱ2两个组分，Ⅱ1经凝胶色谱和SDS-PAGE分析，即为纯化后的β-樱草糖苷酶。现阶段的提取纯化方法多仅限于实验室的操作，为今后实现β-樱草糖苷酶的工业化发展，日本天野酶株式会社［36］获得与β-樱草糖苷酶有着相似功能的二糖苷酶(来自青霉(Pencicillium)以及相应的基因，该新型二糖苷酶分子量(40±5)ku，最适pH为4.5、等电点4.3。该酶可水解包括樱草苷在内的类似二糖糖苷，相较从烟曲霉产生的二糖苷酶，安全性高，酶活性高，耐热性好，在各种食品、药品、准药品领域可广泛应用。

β-樱草糖苷酶的活力表现为催化水解反应的速度，酶催化的反应速度可以用单位时间内底物的消耗量或产物的积累量来表示。测定β-樱草糖苷酶活性主要采用色原底物法，由于市面上暂无4-甲基伞形糖基β-樱草糖苷或pNP-β-樱草糖苷出售，需在木糖苷酶的催化下通过转糖基作用合成。Ma S J等［37-38］将木糖和pNP-葡萄糖苷合成的pNP-β-樱草糖苷，作为β-樱草糖苷酶反应底物，采用pNP(对硝基苯酚)法对β-樱草糖苷酶活性进行测定。董尚胜、童启庆［3］用木糖和4-甲基伞形酮β-葡萄糖苷制成4-甲基伞形酮β-樱草糖苷(4-MUβ-Pri)，通过4-MU法(检测波长为448nm)测定栀子花的β-樱草糖苷酶的活性。目前β-樱草糖苷酶活的测定方法没有统一的标准，致使不同实验得到β-樱草糖苷酶酶活无法进行比较分析，需尽快确立科学的方法。

3 分子生物学研究

基因工程技术可让人们有可能生产出大量的β-樱草糖苷酶，以研究其特性，并应用于食品工业。2002年 Mizutani等［17］根据薮北中纯化到的 β-樱草糖苷酶的部分氨基酸序列，获得了编码β-樱草糖苷酶的cDNA克隆(序列号:AB088027)，全长1729bp，编码507个氨基酸(28个氨基酸的前导肽和479个氨基酸残基的成熟蛋白质)，与多种植物上的β-葡糖苷酶存在50%～60%同源性。费月［39］将β-樱草糖苷酶的ORF框片段，插入原核表达载体pET-32a，转化至表达菌株Rosetta(DE3)pLysS中，经IPTG诱导表达出融合蛋白。

根据已登录的基因，采用实时定量PCR技术，赵丽萍等［40］实验结果表明β-樱草糖苷酶基因在一芽一叶表达量很低，一芽二叶最高(2.49×106copy·μL-1)，而后随着成熟度的增加而降低，β-葡萄糖苷酶基因的表达量明显高于β-樱草糖苷酶基因，一芽二叶和一芽三叶新梢中两个基因的表达量均较高，这恰好符合乌龙茶采摘标准，验证了成品茶花香高低与鲜叶中β-樱草糖苷酶的表达有一定相关性。张广辉［41］利用RT-PCR和GC-MS研究了UV-B处理对β-樱草糖苷酶与β-葡萄糖苷酶基因表达和离体茶树叶片香气成分的影响，结果表明短时间UV-B处理可以刺激糖苷水解酶的基因活性，而使更多的香气前体被水解并释放出香气成分。2014年，Jiang SHI等［42］研究表明，经茉莉酸甲酯处理过的龙井43茶树，叶片中的β-樱草糖苷酶表达水平增加3倍，极显著高于空白对照。综上所述，不同叶位、UV-B以及茉莉酸甲酯处理对β-樱草糖苷酶表达量均有所影响，这为研究茶叶香气形成的分子机理提供了重要的依据。

4 在抗病防御体系中的作用

茶树中的β-樱草糖苷酶对茶叶品质有影响，同时在抗病防御体系中也起到重大作用。在β-樱草糖苷酶催化产生的物质中，3-己烯醇分别具有对害虫的毒性和吸引害虫天敌的直接或间接防御作用［43-44］，还有水杨酸甲酯是诱导多种防御反应的信号物质［45］。戚丽等的研究结果显示，当β-樱草糖苷在浓度为5.0～25.0mg/mL时，对茶树叶部茶炭疽病菌、茶云纹叶枯病菌、茶轮斑病菌和茶赤叶斑病菌均具有明显的抑制作用，糖苷类香气前体组分浓度与抗菌活性呈正相关［46-47］。

综上，具有抗病防御作用的物质是以稳定的β-樱草糖苷形式贮存在茶树叶片中的，当遇到虫害及病菌侵染时，在β-樱草糖苷酶或外源病原菌水解酶的作用下，水解并释放出苷元，从而抵御外界的侵染。

5 问题与展望

在茶叶加工中，要通过人工施用外源β-樱草糖苷酶实现对香气品质的调控，难度大，不可控因素多，从分子角度研究茶树β-樱草糖苷酶，并运用到茶树育种中，能避免上述难题，同时还可以选育出抗逆性强的优质品种。值得关注的是，由于获得反应底物的难度较大，现今暂无统一的β-樱草糖苷酶活性的测定方法，各个研究组的结果不尽相同，难以进行比较分析，但随着更快速、准确的活性测定方法的确定，并能进一步研究在不同环境条件β-樱草糖苷酶活和表达量的变化，寻找酶、香气物质之间的相关性，这有利于发现茶叶加工关键控制点，获得较佳的香气物质组成配比和含量。

目前，人们已基本掌握β-樱草糖苷酶的酶学特性，并运用基因工程法制备β-樱草糖苷酶，对其底物的分布和变化研究也取得了可喜的成果。一方面，β-樱草糖苷酶可用于调节香气成分的提取效率，如茶饮料、化妆品、香水、调味料、药品、木工制品等产品，还能对植物材料、食物和饮料等的色度起到改善作用。另一方面，β-樱草糖苷酶水解反应的产物——樱草糖，已从茶叶中分离获得［48］，可作为糖尿病、肝病患者日常食用的能量来源，同时具有保湿、抗氧化功能等特点，有望取代海藻糖用于化妆品行业。随着β-樱草糖苷酶、β-樱草糖苷及樱草糖的研究进展加深加快，将在茶叶加工、食品深加工及化工行业等得到更广泛的应用。

［1］Bridel M.Primeverose，primeverosides and primeverosidase［J］.CR Acad Sci Paris，1925，180:1421-1425.

［2］GuoW，OgawaK，YamauchiK，etal.Isolationand characterization of β-primeverosidase concerned with alcoholic aroma formation in tea leaves［J］.Biosci Biotechnol Biochem，1996，60:1810-1814.

［3］董尚胜，童启庆.栀子花中糖苷酶的分离及其与醇系香气形成的关系［J］.浙江大学学报:农业与生命科学版，2000，26(1):89-92.

［4］Rao U S，Khamsah S M，Atif A B，et al.Scopoletin(Coumarin extracted from Mengkudu):Chemical，Biological，Molecular and Pharmacokinetic insights-A Review［J］.Research Journal of Pharmacy and Technology，2013，6(9):978-984.

［5］李健民，徐艳明，朱魁元，等.杜仲抗氧化生物活性研究进展［J］.中医药学报，2010(2):137-139.

［6］聂继云，吕德国，李静，等.苹果果实中类黄酮化合物的研究进展［J］.园艺学报，2009(9):1390-1397.

［7］乔蕾，陈晓辉，毕开顺.RP-HPLC测定白土茯苓中甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷的含量［J］.中国中药杂志，2007，18:1900-1902.

［8］Plouvier V.Study and distribution of primeversidase and gentiodiosidase［J］.CR Ser D.1980，29:1071-1074.

［9］宛晓春.茶叶生物化学［M］.北京:中国农业出版社，2003(8):119-127.

［10］丁勇.茶叶中糖苷酶类的研究进展［J］.中国茶叶加工，2001(4):34-36.

［11］Yang Z，Baldermann S，Watanabe N.Recent studies of the volatile compounds in tea［J］.Food Research International，2013 53(2):585-599.

［12］Takeo T.Production of linalool and geraniol by hydrolytic breakdown ofbound formsin disrupted teashoots［J］.Phytochemistry，198l，120(9):2145-2l47.

［13］夏涛，童启庆，董尚胜，等.红茶萎凋发酵中β-葡萄糖苷酶的活性变化［J］.茶叶科学，1996，16(1):63-66.

［14］骆耀平，董尚胜，童启庆，等.7个茶树品种新梢生育过程中β-葡萄糖苷酶活性变化［J］.茶科学，1997，17(增刊):104-107.

［15］江昌俊，李叶云，王朝霞.茶树鲜叶中β-葡萄糖苷酶提取条件的研究［J］.南京农业大学学报，2000，23(2):93-96.

［16］Chen L，Zhao LP，Gao QK.Generation and analysis of expressed sequence tags from the tender shoot cDNA library of tea plant(Camellia sinensis)［J］.Plant Sci，2005，168(2):359-363.

［17］MizutaniM，NakanishiH，EmaJ，etal.Cloningof β-primeverosidase from tea leaves，a key enzyme in tea aroma formation［J］.Plant Physiology，2002，130:2164-2176.

［18］Guo W，Yamauchi K，Watanabe N，et al.A primeverosidase as a main glycosidase concerned with the alcoholic aroma formation in tea leaves［J］.Biosci Biotechnol Biochem，1995，59:962-964.

［19］Matsumura S，Takahashi S，Nishikitani M，et al.The role of diglycosides a tea aroma precursors:synthesis of tea digly-cosides and specificity of glycosidases in tea leaves［J］.J Agric Food Chem，1997，45:2674-2678.

［20］Ijima Y，Ogawa K，Watanabe N，et al.Characterization ofprimevrosidase，being concerned with alcoholic aroma formation in tea leaves to be processed into black tea，and preliminary observation on its substrate specificity［J］.J Agric Food Chem，1998，46:1712-1718.

［21］Han W W，Li Z S，Zheng Q C，et al.Toward a blueprint for β-primeverosidase from tea leaves structure/function properties:homology modeling study［J］.JournalofTheoreticaland Computational Chemistry，2006(1):433-446.

［22］Guo W，Sakata K，Watanabe N，et al.Geranyl 6-O-β-D-xylopyranosyl-β-d-glucopyranoside isolated as an aroma precursor from tea leaves for oolong tea［J］.Phytochemistry，1993，33(6):1373-1375.

［23］Wang D，Yoshimura T，Kubota K，et al.Analysis of glycosidically bound aroma precursors in tea leaves.1.Qualitative and quantitative analyses of glycosides with aglycons as aroma compounds［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48(11):5411-5418.

［24］Yano M，Joki Y，Mutoh H，et al.Benzyl glucoside from tea leaves［J］.Agric Biol Chem，1991，55(4):1205-1206.

［25］Kobayashi A，Kubota K，Joki Y，et al.(Z)-3-Hexenyl-β-D-glucopyranoside in fresh tea leaves as a precursor of green odor［J］.Biosci Biotech Biochem，1994，58(3):592-593.

［26］Nishikitani M，Kubota K，Kobayashi A，et al.Geranyl 6-O-α-L-arabinopyranosyl-β-D-glucopyranoside isolated as an aroma precursor from leaves of a green tea cultivar［J］.Biosci Biotech Biochem，1996，60:929-931.

［27］Guo W，Sasaki N，Fukuda M，et al.Isolation of an aroma precursor of benzyldehyde from tea leaves(Camellia sinensis var.sinensis cv.Yabukita)［J］.Biosci Biotech Biochem，1998，62(10):2052-2054.

［28］Sakata K，Guo W，Moon J-H.Tea Chemistry Part II:With special reference to tea aroma precursors［M］.In Gloval Advances in Tea Science;N.K.Jain，Eds;Aravali Books International:New Delhi，1999:692-704.

［29］Sakata K.β -Primeverosidase relationship with floral tea aroma formation during processing of oolong tea and black tea［M］.In Caffeinated Beverages，Health Benefits，Physiological Effects，and Chemistry;T.H.Parliament，C.Ho，and P.Schieberie，Eds;American ChemicalSociety，Washington，DC，2000:327-335.

［30］Ma S-J，Watanabe N，Yagi A，et al.The(3R，9R)-3-hydroxy-7，8-dihydro-β-ionol disaccharide glycoside is an aroma precursor in tea leaves［J］.Phytochemistry，2001，56:819-825.

［31］张正竹，宛晓春，陶冠军.茶鲜叶中糖苷类香气前体的液质联用分析［J］.茶叶科学，2005，25(4):275-281.

［32］张正竹，宛晓春，施兆鹏，等.茶鲜叶在不同季节及绿茶加工贮藏过程中糖苷类香气前体含量变化研究［J］.食品发酵与工业，2003，29(3):1-4.

［33］Wang D，Kurasawa E，Yamaguchi Y，et al.Analysis of glycosidically bound aroma precursors in tea leaves.2.changes in glycoside contents and glycosidase activities in tea leaves during the black tea manufacturing process［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49(4):1900-1903.

［34］Wang D，Kubota K，Kobayashi A，et al.Analysis of glycosidically bound aroma precursors in tea leaves.3.Change in the glycoside content of tea leavesduringtheoolongtea manufacturing process［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49(11):5391-5396.

［35］Ogawa K，Ijima Y，Guo W，et al.Purification of aβ -primeverosidase concerned with alcoholic aroma formation in tea leaves(cv.Shuixian)to be processed to oolong tea［J］.J Agric Food Chem，1997，45:877-882.

［36］鹤喰寿孝，森茂治，小出芳直.新型二糖苷酶以及编码该二糖苷酶的基因:日本，WO2007013539 A1［P］.2008-07-30.

［37］Ma S J，Mizutani M，Hiratake J，et al.Substrate specificity of β-primeverosidase，a key enzyme in aroma formation during oolong tea and black tea manufacturing ［J］ .Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2001，65(12):2719-2729.

［38］董尚胜，钱利生.窨茶用栀子花中糖苷酶活性与醇类香气的研究［J］.茶叶科学，2002，22(1):25-29.

［39］费月.与茶叶香气形成相关的三个内源糖苷酶基因的克隆和原核表达［D］.合肥:安徽农业大学，2012.

［40］赵丽萍，陈亮，王新超，等.茶树新梢不同叶片中 β-葡萄糖苷酶和β-樱草糖苷酶基因表达的实时定量PCR分析［J］.茶叶科学，2006，26(1):11-16.

［41］张广辉，茶树遗传转化及UV-B对香气相关基因表达影响的研究［D］.杭州:浙江大学，2007-01.

［42］Jiang SH，LI W，Cheng ying M A，et al.Aroma changes of black tea prepared from methyl jasmonate treated tea plants［J］.Journal of zhejiang University Science，2014，15(4):313-321.

［43］Mattiacci I，Dicke M.β -Glucosidases:all elicitor of herbivore-induced plant odor that attracts host-searching parasitic wasps［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92:2036-2040.

［44］Pichersky E，Gershenzon J.The formation and function of plant volatiles:perfumes for pollinator attraction and defense［J］.Curropin Plant Biol，2002，5:237-243.

［45］Ryals JA，Neuenschwander UH，Willits MG，et al.Systemic acquired resistance［J］.Plant Cell，1996，8:1809-1819.

［46］戚丽.游离态香气和糖苷类香气前体对茶树叶部致病真菌的抑制作用［D］.合肥:安徽农业大学，2008.

［47］戚丽，吴慧平，宛晓春，等.茶叶中游离态和键合态香气组分对茶云纹叶枯病致病菌的抑制作用［J］.南京农业大学学报，2008(1):42-46.

［48］董尚胜.茶叶中分离得到低能量糖──樱草糖［J］.茶叶，1997(4):36.