2011—2012年海南省淋球菌耐药性监测及基因分型

钟娜 刘巧 乔凤 郑文爱 王芳乾 王黎明 吴碧玉 范和发

2011—2012年海南省淋球菌耐药性监测及基因分型

钟娜 刘巧 乔凤 郑文爱 王芳乾 王黎明 吴碧玉 范和发

目的探讨海南淋球菌耐药状态及耐药基因分型情况。方法用琼脂稀释法测定4种抗生素的最低抑菌浓度(MIC),PCR方法鉴定四环素高度耐药菌株(TRNG)并进行TetM基因分型;用纸片酸度法测定β内酰胺酶(PPNG),PCR方法鉴定β内酰胺酶质粒并进行TEM-1基因分型。结果2011—2012年共检测214株淋球菌,环丙沙星中度敏感率7.94%(17/214),耐药率为92.06%(197/214);头孢曲松敏感率24.30%(52/214),中度敏感率为75.70%(162/214);未发现耐大观霉素的菌株。多重耐药情况：对四环素和青霉素耐药的菌株39株(18.22%),对青霉素和环丙沙星耐药菌株66株(30.84%),对四环素和环丙沙星耐药的菌株91株(42.52%),对四环素、青霉素和环丙沙星耐药的菌株37株(17.29%)。检出TRNG 101株(47.20%),TetM基因分型结果99株(98.02%)荷兰型,2株(1.98%)美国型。检出PPNG 65株(30.37%),TEM-1基因分型结果55株(84.62%)亚州型,10株(15.38%)非州型,未见多伦多型、里约型。结论海南省淋球菌对大观霉素敏感率高,应作为治疗淋病的首选药物;多重耐药菌株应引起重视。PPNG以亚州型为主,非州型次之;TRNG以荷兰型为主,偶见美国型。

奈瑟球菌,淋病;抗药性;基因,TetM;基因,TEM-1;基因型

为了解海南省淋球菌耐药流行状态及耐药基因分型情况,2011—2012年我们收集全省7个市县皮肤病防治所的菌株共214株,用4种抗生素进行耐药检测及TetM基因,TEM-1基因分型,现将结果报道如下。

资料和方法

一、材料

1.菌株来源：2011年1月至2012年10月,从海南省皮肤性病防治中心、三亚市慢性病防治中心、琼海市皮肤性病防治中心、陵水县皮肤性病防治所、澄迈县皮肤性病防治所等单位性病门诊患者泌尿生殖道中分离到的214株淋球菌。男性标本取自尿道口内3～4 cm处,女性标本取宫颈口内1～2 cm处,接种于选择性培养基培养,所有菌株经培养24～48 h经革兰染色、氧化酶和糖发酵试验确证后洗于脱脂牛奶-80℃冻存备用。

2.抗菌药物：四环素、环丙沙星、头孢曲松、大观霉素药粉由中国医学科学院皮肤病研究所、中国疾病预防控制中心性病中心性病参比实验室提供。

3.培养基：GC基础培养基(英国Oxoid公司生产)加入10%脱纤维新鲜羊血。

4.标准菌株：世界卫生组织(WHO)G、J、L 共 3 株淋球菌标准菌株由中国医学科学院皮肤病研究所、中国疾病预防控制中心性病中心性病参比实验室提供。

5.试剂及仪器：Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA相对分子量标记物(DL1000)等PCR试剂,均购自宝生物工程(大连)有限公司;PCR引物由上海Invitrogen生物工程公司合成。PCR仪(Veriti)为美国ABI公司产品,电泳仪及凝胶成像系统(ChemiDOC XRS+)均为美国Bio-Rad公司产品。

二、方法

1.菌株收集：海南省皮肤性病防治中心每年定期给协作单位发放收集菌株的脱脂牛奶和T-M培养基,合作单位2个月内将收集的菌种送达海南省皮肤性病防治中心,将菌株存放在-80℃低温冰箱保存备用。

2.最小抑菌浓度(MIC)测定：用琼脂稀释法。培养基中抗菌药物质量浓度范围为：环丙沙星(0.002～16 mg/L)、头孢曲松(0.002～2 mg/L)、大观霉素(2～64 mg/L);四环素(8～16 mg/L),检测质粒介导的高度耐四环素淋球菌(TRNG)。每批试验用已知MIC值的WHO标准株参照菌株进行质量控制。

3.药敏试验结果判定标准：以WHO西太区淋球菌耐药监测项目推荐的标准[1]判定结果,头孢曲松MIC≤0.03 mg/L为敏感,0.06～0.50 mg/L为中度敏感,≥1 mg/L为耐药;大观霉素MIC≤64 mg/L为敏感,≥128 mg/L为耐药;环丙沙星MIC≤0.03 mg/L为敏感,0.06～0.50 mg/L为中度敏感,≥1 mg/L为耐药;四环素MIC≥16 mg/L为TRNG。

4.β内酰胺酶测定：用纸片酸度法测定菌株的β内酰胺酶,滤纸吸足其溶液后用接种环取10～20个菌落涂到滤纸上,涂抹直径5 mm。产青霉素酶淋球菌(PPNG)菌株使滤纸颜色由紫变黄色。每次试验均以WHO J株作为阳性对照,L株作为阴性对照。

5.PCR模板DNA的提取：取GC培养基上纯培养18 h的淋球菌菌落,用100 μl去离子水制备成菌悬液,浓度相当于1个麦氏单位;将菌悬液置于95℃干式恒温仪15 min,冷却后12 000×g低温(4℃)离心10 min,上清液即为PCR用模板DNA;分离上清液,保存于-20℃备用。

6.PPNG的TEM-1基因分型：用Palmer等[2]使用的引物和方法测定淋球菌TEM-1基因。引物有 4 条,包括 BL1：5′-TACTCAATCGGTAATTGGC T-3′,BL2：5′-CACCTATAAATCTCGCAAGC-3′,BL3：5′-CCATAGTGTTGAGTATTGCGAA-3′,BL4：5′-TCATTCGTGCGTTCTAGGA-3′。反应总体系 25 μl,其中主要包括Taq酶0.625U,dNTP各0.2mmol/L,MgCl21.5 mmol/L,引物各 0.4 μmol/L,模板 5 μl。PCR 反应条件为：94℃预变性3 min;94℃变性15 s,64℃退火15 s,72℃延伸1 min,共30个循环;最后72℃延伸7 min。每批试验设阴性和阳性对照,扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统观察并照相。

7.TRNG的tetM基因分型：用Turner[3]方法测定tetM基因型。引物有3条,包括1条通用正向引物(UF)：5′-CTCGAACAAGAGGAAAGC-3′,两条反向引物分别为美国型(AR 778 bp)：5′-GCATTCCAC TTCCCAAC-3′和荷兰型(DR 443 bp)：5′-TGCAGC AGAGGGAGG-3′。反应总体系25 μl,包括Taq酶(5 U)0.125 μl,dNTP(2.5 μmol)2 μl,10 × PCR 缓冲液 2.5 μl,引物(10 μmol/L)各 0.5 μl,DNA 模板2 μl。PCR反应条件：预变性94℃,3 min;变性94℃,20 s;退火55℃,1 min;延伸72℃,90 s;30个循环;最后延伸72℃,7 min结束。每批试验作阴性和阳性对照。扩增产物以0.8%琼脂糖凝胶电泳,用紫外分析仪观察结果,最后用Bio-print凝胶成像系统观察并照相。

8.统计学处理：计数资料用SPSS15.0软件作χ2检验。

结 果

1.质粒介导的淋球菌耐药性：对214株淋球菌进行检测,产青霉素酶淋球菌(PPNG)阳性65株(30.37%),TRNG 101株(47.20%)。2011年PPNG阳性率为28.71%(29/101),2012年PPNG阳性率为31.86%(36/113),两年间差异无统计学意义(χ2=0.25,P＞0.05)。2011年TRNG阳性率为53.47%,2012年TRNG阳性率为41.59%,两年间TRNG的阳性率有所下降,但差异无统计学意义(χ2=3.02,P＞0.05);见表1。

2.染色体介导的淋球菌耐药性：2011—2012年,染色体介导的耐药性(环丙沙星、头孢曲松和大观霉素)淋球菌比例及抗菌药物耐药情况：环丙沙星的耐药率从2011年的98.02%下降到2012年的86.73%,两年间耐药率明显下降,差异有统计学意义(χ2=9.30,P＜0.01);头孢曲松的中度敏感率从2011年82.18%下降到2012年的69.91%,两年间中度敏感率有所下降。未发现耐大观霉素的菌株,见表2。

3.多重耐药情况：2011—2012年,两重耐药(青霉素和四环素)耐药率从21.78%下降到15.04%,但差异无统计学意义(χ2=1.62,P＞0.05);两重耐药(四环素和环丙沙星)耐药率从53.47%下降到32.74%,差异有统计学意义(χ2=9.37,P＜0.01),青霉素和环丙沙星耐药率无显著改变;三重耐药率(青霉素、四环素和环丙沙星)明显下降,但差异无统计学意义(χ2=2.70,P＞0.05);虽然多重耐药率有所下降,但在治疗淋病时也要考虑青霉素类、四环素类和喹诺酮类的交叉耐药情况,应避免使用。见表3。

表1 2011—2012年海南省214株淋球菌质粒介导的耐药性[例(%)]

表2 2011—2012年海南省214株淋球菌染色体介导的耐药性[例(%)]

表3 2011—2012年海南省214株淋球菌多重耐药情况[例(%)]

4.TEM-1基因质粒分型检测：对收集的65株PPNG进行TEM-1基因质粒分型,检测出10株携带非洲型质粒,占15.38%;55株携带亚洲型质粒,占84.62%;未见多伦多型和里约型质粒。2011年PPNG阳性29株,其中非洲型质粒3株,占10.34%;亚洲型质粒26株,占89.66%。2012年PPNG阳性36株,其中非洲型质粒7株,占19.44%;亚洲型质粒29株,占80.56%,携带非洲型质粒的菌株明显增多。见图1。

5.TRNG tetM基因分型：101株TRNG进行tetM基因PCR扩增,所有菌株均扩增出产物,与DNA分子量标记物作比较,其中99株(98.02%)扩增出443 bp产物,即为荷兰型;2株(1.98%)扩增出778 bp产物,即为美国型(图2)。

图1 产青霉素酶淋球菌TEM-1-β内酰胺酶扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析 M：标准参照物;1：标准菌株WHO J株;3～4：含非洲型质粒产青霉素酶淋球菌临床分离株;2,5,6：含亚洲型质粒产青霉素酶淋球菌临床分离株;7：阴性对照

图2 高度耐四环素淋球菌tetM基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析 M：标准参照物;1～6,8～9：高度耐四环素淋球菌临床分离株;7：WHO G株

讨 论

近两年共检测214株淋球菌,染色体耐药的淋球菌对环丙沙星的耐药性由2011年的98.02%下降到2012年的86.73%,总阳性率为92.06%,;与国内其他一些地区如广州[4]、南京[5]等报告的对环丙沙星的耐药率也均大于90%相近。头孢曲松的中度敏感率从2011年的82.18%下降到2012年的69.91%,显著高于韩燕等[6]报道的47.42%。未检出耐大观霉素的淋球菌。本研究说明,海南省不能用环丙沙星治疗淋病,头孢曲松中度敏感率较高,临床使用其治疗淋病时应观察其疗效,避免不规则用药;大观霉素可作为治疗淋病的首选药物,但也要持续监测其耐药性。多重耐药(对青霉素和四环素、四环素和环丙沙星、青霉素、四环素和环丙沙星耐药)耐药率两年间有所下降,对青霉素和环丙沙星耐药率无显著改变,比韩燕等[6]、朱邦勇等[7]报道的多重耐药率均低,但淋球菌多重耐药情况也应引起临床重视。

质粒耐药的淋球菌2011—2012年PPNG总阳性率为30.37%,与韩燕等[6]报道2008年中国淋球菌耐药株PPNG阳性率34.91%相似。我们2011年从29株PPNG中检测出3株(10.34%)含非洲型质粒,26株(89.66%)含亚州质粒;2012年从36株PPNG中检测出7株(19.44%)含非洲型质粒,29株(80.56%)含亚州型质粒。共检出含非洲型质粒10株总阳性率为15.38%,明显高于吴兴中等[8]报道的广州地区2000—2008年分离的230株PPNG进行TEM-1基因质粒分型,229株携带亚洲型质粒,只在2008年检测出1株含非洲型质粒(χ2=27.52,P＜0.01)。表明海南省淋球菌PPNG流行株非州型高于广州地区。因本地区临床治疗淋病基本不使用青霉素及近年国内也未见青霉素耐药检测的报道,所以本研究未做青霉素耐药检测,

淋球菌对四环素的高度耐药是由tetM基因介导,tetM基因可分为美国型和荷兰型2种变型。我们对101株TRNG进行tetM基因检测,结果99株(98.02%)为荷兰型,2株(1.98%)为美国型。表明海南省近年流行的TRNG菌株以荷兰型tetM基因为主,偶发美国型,与南京[9](98.82%)的报道相似。海南省首次分离出TRNG美国型tetM基因和PPNG非洲型质粒,且1株同时携带美国型tetM基因和PPNG非洲型质粒,为双重耐药质粒。TRNG tetM基因美国型可能来源于非洲大陆近赤道地区,国际旅行使两种基因型传播到其他地区。表明本地区有TRNG tetM基因美国型和PPNG TEM-1非洲型流行,继续对PPNG、四环素进行耐药监测和分子流行病学研究,了解当地PPNG、TRNG流行株的基因型,及时给政府有关部门提供科学防治依据很有必要。

[1]WordHealthOrganization.SensitivitytestingofNeisseriagonorrhoeae:methodlogies for use by participants in the WHO Western Pacific RegionalSurveillance Programme.In:WHO/WPR regional antimicrobial surevillance working group meeting proceedings[M].1992:33.

[2]Palmer HM，Leeming JP，Turner A.A multiplex polymerase chain reaction to differentiate beta-lactamase plasmids of neisseria gonorrhoeae[J].J Antimicrob Chemother，2000，45(6):777-782.

[3]Turner A，Gough KR，Leeming JP.Molecular epidemiology of tetM genes inNeisseria gonorrhoeae[J].Sex Transm Infect，1999，75(1):60-66.

[4] 曹文苓，黎小东，毕超，等.广州地区74株淋球菌耐药性结果分析[J].中国微生态学杂志，2009，21(6):553-554.

[5] 戴秀芹，孙厚华，尹跃平.2007年南京地区淋球菌分离株对抗生素的敏感性测定[J].中国艾滋病性病，2009，15(2):183-184.

[6] 韩燕，尹跃平，戴秀芹，等.2008年中国淋球菌临床分离株耐药性的流行病学研究[J].中华皮肤科杂志，2011，44(7):472-475.

[7]朱邦勇，李伟，黄培勇，等.淋球菌耐药监测的流行病学研究[J].中国麻风皮肤病杂志，2009，25(1):32-34.

[8] 吴兴中，郑和平，黄进梅，等.质粒介导β-内酰胺酶淋球菌的检测及其TEM-1基因质粒分型[J].中华皮肤科杂志，2010，43(5):363-365.

[9] 蒋法兴，其木格，戴秀芹，等.南京地区1999-2004年四环素高度耐药淋球菌terM基因分型及流行研究[J].中华皮肤科杂志，2007，40(3):133-134.

2013-07-05)

(本文编辑：吴晓初)

Antibiotic resistance surveillance in and genotyping ofNeisseria gonorrhoeaeisolates from Hainan province during 2011-2012

Zhong Na*，Liu Qiao，Qiao Feng，Zheng Wenai，Wang Fangqian，Wang Liming，Wu Biyu，

Fan Hefa.*Hainan Provincial Center for Skin Disease and STD Control，Haikou 570206，China

Liu Qiao，Email:drliuqiao@163.com

ObjectiveTo evaluate the antibiotic resistance inNeisseria gonorrhoeae(NG)isolates from Hainan province，and to assess their genotypes according to antibiotic resistance-associated genes.MethodsTotally，214 NG strains isolated from Hainan province during 2011-2012 were included in this study.An agar dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentrations(MICs)of ciprofloxacin，ceftriaxone，spectinomycin and tetracycline in these strains.The production of β-lactamase was tested by a paper acidometric method.PCR was performed to amplify the tetM gene in TRNG strains and TEM-1 gene in penicillinase-producing NG(PPNG)strains for their genotyping.ResultsAmong these NG strains，7.94%(17/214)were moderately sensitive to ciprofloxacin with a resistance rate of 92.06%(197/214)，24.30%(52/214)were sensitive to ceftriaxone with a moderate sensitivity rate of 75.70%(162/214)，and none was resistant to spectinomycin.Additionally，39 isolates(18.22%)were concurrently resistant to both tetracycline and penicillin，66 isolates(30.84%)to penicillin and ciprofloxacin，91 isolates(42.52.%)to tetracycline and ciprofloxacin，and 37 isolates(17.29%)to tetracycline，penicillin and ciprofloxacin.Totally，101 TRNG strains were identified from all the isolates，of which，99(98.02%)harbored the Dutch variant of the tetM gene，and 2(1.98%)harbored the American variant.There were 65(31.31%)PPNG strains in these isolates，among which，55(84.62%)carried the Asian type plasmids，10(15.38%)carried the Africa type plasmids，and none carried the Toronto or Rio type plasmids.ConclusionsThe NG isolates from Hainan province is highly sensitive to spectinomycin，which should serve as the first treatment choice for gonorrhea.More attention should be paid to multi-drug resistance in NG.In this region，most PPNG strains carry the Asian type plasmids，followed by the Africa type plasmids，and the Dutch variant of the tetM gene is the most common variant among TRNG strains with the American variant as the occasional form.

Neisseria gonorrhoeae;Drug resistance;Genes，TetM;Genes，TEM-1;Genotype

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.05.004

海南省自然科学基金(811171)

570206海口,海南省皮肤性病防治中心(钟娜、刘巧、乔凤、郑文爱、王芳乾);海南省琼海市皮肤性病防治中心(王黎明);海南省澄迈县皮肤性病防治所(吴碧玉);海南省三亚市慢性病防治中心(范和发)

刘巧,Email：drliuqiao@163.com