混菌固态发酵银杏叶渣生产蛋白饲料的研究

周 昊 王成章 叶建中 陈虹霞 陶 冉

（1．中国林业科学研究院林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局林产化学工程重点开放性实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏南京 210042；2．中国林业科学研究院林业新技术研究所，北京 100091）

随着畜牧业的发展，饲料的需求量越来越大。而饲料生产量，尤其是蛋白饲料的不足已经成为全球性问题，因此积极利用各种废弃物生产蛋白饲料已成为国内外研究的热点[1-2]。银杏叶渣是生产银杏提取物过程中产生的废渣，我国每年大概产生3万吨的银杏叶渣，银杏叶渣中含有丰富的蛋白质、氨基酸、多糖、VC、VE、胡萝卜素、矿物质和微量元素等营养成分，目前银杏叶渣大多未加利用，被直接扔掉或焚烧，不仅造成资源的严重浪费，而且严重污染环境[3-4]。

固态发酵技术相对于液态发酵技术具有高产、简易、低投资、低能耗等优点[5]，特别是应用于废渣废料的处理，易干燥、高回收，可把发酵物（包括发酵底物、菌体及其代谢产物）全部利用，既保留了活性成分又不会产生废液污染[6]。因此利用微生物固态发酵技术，用银杏叶提取物加工过程中产生的大量银杏叶渣生产出蛋白饲料，提高银杏叶渣的蛋白质含量及营养价值，可变废为宝，开辟饲料新资源，避免废渣对环境的污染，具有良好的经济效益和社会效益。本研究以银杏叶渣为原料，以米曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和热带假丝酵母混合菌种为发酵菌种，研究了银杏叶渣固态发酵生产菌体蛋白饲料适宜的工艺条件，对提高银杏叶渣的综合利用价值，减少环境污染具有深远的意义。

1 试验材料与仪器

1.1 材料

原辅料：银杏叶渣：由邳州鑫源生物制品有限公司提供。本文中若无特别说明，药渣质量均以绝干物料计量。

试剂：尿素、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾等，均为分析纯。

培养基：麦芽汁琼脂培养基：5°Bé～6°Bé，pH值约为6.5，加入2 g/100 ml琼脂即可。不加琼脂即为麦芽汁液体培基。

Czapek’s琼脂培养基：蔗糖3%，NaNO30.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，KCl 0.05%，FeSO4·4H2O 0.001%，K2HPO40.1%，琼脂1.5%，pH值6.0～6.5。

PDA培养基：马铃薯浸取液中加入2%葡萄糖和1.5%琼脂。

MRS培养基：酪蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，葡萄糖0.5%，乙酸钠0.5%，柠檬酸二胺0.2%，吐温80 0.1%，K2HP040.2%，MgS04·7H2O 0.02%，MnSO4·H2O 0.005%，CaCO32%,琼脂1.5%，pH 6.8。

BPY琼脂培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，琼脂1.5%，pH7.0。

1.2 试验菌种

热带假丝酵母（Candida tropicalis）2.1776、产朊假丝酵母（Candida utilis）2.1059、白地霉（Geotrichum candidum）2.1132、米曲霉（Aspergillus oryzae）3.5232、黑 曲 霉（Aspergillusniger）3.5439、绿 色 木 霉（Trichoderma viride）3.5455、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp.Subtilis）1.1630、植 物 乳 杆 菌（Lactobacillus plantarum）1.0556（中国普通微生物菌种保藏管理中心）。

1.3 试验仪器

生化培养箱（RXZ-280B）：宁波江南仪器厂；往复式水浴恒温摇床（ZWY-110X30）：上海智城分析仪器制造有限公司；凯氏定氮仪（KDN-08D）：上海昕瑞仪器仪表有限公司；立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-30KBS）：上海申安医疗器械厂；洁净工作台（SW-CJ-2D）∶苏州净化设备有限公司。

2 试验方法

2.1 菌种的扩大培养[7]

黑曲霉菌和米曲霉菌：分别将黑曲霉菌、米曲霉菌原种接到Czapek’s琼脂斜面培养基上，28℃培养72 h，再接到250 ml三角瓶Czapek’s液体培养基中，28℃恒温摇床（120 r/min）培养72 h。

热带假丝酵母菌、产朊假丝酵母和白地霉：分别将热带假丝酵母菌、产朊假丝酵母和白地霉原种接到麦芽汁斜面培养基上，28℃培养72 h，再接到250 ml三角瓶麦芽汁液体培养基中，28℃恒温摇床（120 r/min）培养72 h。

绿色木霉：将绿色木霉原种接到PDA斜面培养基上，在28℃培养72 h，再接到250 ml三角瓶PDA液体培养基中，28℃恒温摇床（120 r/min）培养72 h。

枯草芽孢杆菌：将枯草芽孢杆菌原种接到BPY琼脂斜面培养基上，在28℃培养72 h，再接到250 ml三角瓶BPY液体培养基中，28℃恒温摇床（120 r/min）培养72 h。

植物乳杆菌：将植物乳杆菌原种接到MRS斜面培养基上，在28℃培养72 h，再接到250 ml三角瓶MRS液体培养基中，28℃恒温摇床（120 r/min）培养72 h。

2.2 银杏叶渣发酵工艺流程

斜面菌种→种子培养↓银杏叶渣→干燥→粉碎过40目筛→配料→混合→固态恒湿发酵→烘干至恒重→分析测定。

2.3 银杏叶渣固态发酵工艺条件的优化

2.3.1 单一菌种发酵试验

在250 ml的锥形瓶中装入混合均匀的银杏叶渣固态发酵培养基，料水比为1∶3，氮源添加量为5%，灭菌，冷却后，分别接入10%的热带假丝酵母、产朊假丝酵母、白地霉、米曲霉、黑曲霉、绿色木霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌,在30℃，自然pH值下静止发酵72 h后,将产物在50℃条件下烘干至恒重,分析测定其粗蛋白含量。

2.3.2 复合菌种发酵试验[8]

将单菌发酵试验中筛选出的粗蛋白含量较高的酵母菌、霉菌与植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌进行进行2菌（接种比例1∶1）、3菌（接种比例1∶1∶1）和4菌（接种比例1∶1∶1∶l）的复合发酵试验。复合菌种的组合有7种，分别为①霉菌+酵母菌；②霉菌+枯草芽抱杆菌；③霉菌+植物乳杆菌；④霉菌+酵母菌+枯草芽抱杆菌；⑤霉菌+酵母菌+植物乳杆菌；⑥霉菌+枯草芽抱杆菌+植物乳杆菌；⑦霉菌+酵母菌+枯草芽抱杆菌+植物乳杆菌。

2.3.3 最佳菌种比例试验[9]

为得到最佳菌种比例组合，向固体发酵培养基中分别按10%的接种量接入不同比例的酵母菌、霉菌、枯草芽抱杆菌和植物乳杆菌的菌液，进行发酵试验，接种比例分别为 1∶1∶2∶1、2∶2∶1∶1、1∶2∶2∶1、2∶1∶1：1、2∶1∶2∶1、1∶2∶1∶1，测定发酵产物的粗蛋白含量。

2.3.4 接种量的确定[10]

将筛选出的复合菌种分别按6%、8%、10%、12%、15%的接种量接入固体发酵培养基，料水比为1：3，氮源添加量为8%，灭菌，冷却后，在30℃，自然pH值下静止发酵72 h后,将产物在50℃条件下烘干至恒重,分析测定其粗蛋白含量。

2.3.5 发酵时间的确定

将筛选出的复合菌种分别按10%的接种量接入固体发酵培养基，料水比为1：3，氮源添加量为8%，灭菌，冷却后，在30℃，自然pH值下，分别静止发酵A：24 h，B：48 h，C：72 h，D：96 h，E：120 h，将产物在50℃条件下烘干至恒重,分析测定其粗蛋白含量。

2.3.6 料水比的确定[11]

将筛选出的复合菌种分别按10%的接种量接入固体发酵培养基，料水比分别取1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，氮源添加量为8%，灭菌，冷却后，在30℃，自然pH值下，分别静止发酵72 h，将产物在50℃条件下烘干至恒重,分析测定其粗蛋白含量。

2.3.7 氮源（尿素）添加量的确定[12]

将筛选出的复合菌种分别按10%的接种量接入固体发酵培养基，料水比为1：3，分别选取尿素和硫酸铵作为培养基氮源，氮源添加量分别为3%、5%、8%、10%、12%，灭菌，冷却后，在30℃，自然pH值下，分别静止发酵72 h，将产物在50℃条件下烘干至恒重,分析测定其粗蛋白含量。

2.4 指标成分测定方法

银杏叶渣中粗蛋白测定采用凯氏定氮法（GB/T6432-94），粗纤维测定采用酸碱洗涤法（GB/T6434-94），粗灰分测定采用高温灼烧法（GB/T6438-2007），粗脂肪测定采用索氏提取法（GB/T6433-94），多糖测定采用硫酸蒽酮法（GB/T15038-2006）。

3 结果与讨论

3.1 单一菌种发酵试验（见图1）

从图1可以看出，向固体发酵培养基中接入单一菌种均能提高发酵产物的粗蛋白含量，而发酵产物中粗蛋白含量最高的4种菌种为A热带假丝酵母（28.22%）、D米曲霉（32.55%）、G枯草芽抱杆菌（29.01%）和H植物乳杆菌（27.97%）。加入热带假丝酵母后的固体发酵产物中，有淡淡的醇香味，粗蛋白含量提高2.06倍，其原因在于热带假丝酵母自身中的菌体蛋白含量比较高；加入枯草芽孢杆菌的发酵产物中粗蛋白含量可以提高2.14倍，这是由于其菌体内具有活性较高的蛋白酶，可用合成大量的蛋白质，来提高粗蛋白含量；加入米曲霉，发酵产物表面形成大片的白色菌丝体，之后逐渐转变为黄褐色，发酵产物粗蛋白含量提高了2.53倍，其原因是米曲霉可产生大量的淀粉酶、纤维素酶、果胶酶和蛋白酶，能使银杏叶渣中的纤维素分解为可利用的碳源，促进发酵效果，同时产生蛋白质；加入植物乳杆菌的发酵产物中粗蛋白含量可以提高2.03倍，其原因在于其可产生大量的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等消化酶，从而可促进蛋白质的合成。因此，在以后的混合菌种发酵试验中所选用的菌株为：A热带假丝酵母、D米曲霉、G枯草芽抱杆菌和H植物乳杆菌。

3.2 复合菌种发酵试验

根据单一菌种发酵实验结果选出的发酵产品蛋白含量较高的热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽抱杆菌和植物乳杆菌进行复合菌种的组合试验，分别为D+A（米曲霉+热带假丝酵母）、D+G（米曲霉+枯草芽孢杆菌）、D+H（米曲霉+植物乳杆菌）、D+A+G（米曲霉+热带假丝酵母+枯草芽孢杆菌）、D+A+H（米曲霉+热带假丝酵母+植物乳杆菌）、D+G+H（米曲霉+枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌）、D+A+G+H（米曲霉+热带假丝酵母+枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌）。

从图2可以看出，3菌和4菌组合发酵的产物的粗蛋白含量明显高于2菌组合，其中米曲霉+热带假丝酵母+枯草芽孢杆菌的3菌组合和米曲霉+热带假丝酵母+枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌的4菌组合发酵产物粗蛋白含量最高，分别为40.57%和41.26%。通过观察发酵产物，在产物表面及内部有大量菌丝体，发酵产物成褐色，具有浓郁的酒香味。分析其中原因，是因为米曲霉能够产生多种纤维素酶类和果胶酶类，这些酶类有助于银杏叶渣中纤维素的降解，同时产生糖类物质，而枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和产朊假丝酵母可以利用这些糖类物质大量生产并产生菌体蛋白，通过复合菌剂中不同微生物的协同作用最终提高发酵产物粗蛋白含量。由于米曲霉+热带假丝酵母+枯草芽孢杆菌的3菌组合和米曲霉+热带假丝酵母+枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌的4菌组合发酵产物粗蛋白含量相差不大，但是考虑到植物乳杆菌发酵可产生乳酸，可使物料处于低酸度的环境，从而有效防止有机物质和原料的变质，使有益微生物急剧增加，抑制了有害细菌的生长，能增强动物的体液免疫和细胞免疫，另外加入植物乳杆菌还可以改善饲料的适口性。综合考虑，选择最佳菌种组合为米曲霉+热带假丝酵母+枯草芽孢杆菌+植物乳杆菌。

3.3 最佳菌种比例试验（见图3）

由图3可知，当热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的接种比例为2∶2∶1∶1时，发酵产物中粗蛋白含量最高，达到45.85%。接入米曲霉比例为1时的菌种组合的发酵产物粗蛋白含量都偏低，这是由于米曲霉产生的糖化酶及纤维素酶减少，不利于银杏叶渣中的纤维素分解。同时发酵物料中可利用的糖减少，使得热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的生长繁殖受到限制。此外，热带假丝酵母对发酵产物的适口性有较大影响，不能含量过少。所以确定米曲霉、热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的最佳接种比例为2∶2∶1∶1。

3.4 接种量的确定（见图4）

从图4可以看出，接种量为10%时，发酵产物中粗蛋白含量最高，为45.38%，当接种量增加为12%时，发酵产物中粗蛋白含量未见增长。而当接种量为15%时，发酵产物中的粗蛋白含量反而降低，原因可能是接种量过大，使菌种生长过快，培养物黏度增加，导致溶氧不足，影响产物中蛋白质的合成。从生产考虑，接种量的减少意味着生产便利和成本的降低，因此应该在允许的范围内尽可能降低接种量。本试验10%和12%接种量对发酵产物蛋白含量影响差异不显著。从节约生产成本角度，综合考虑，选择10%的接种量最为合适。

3.5 发酵时间的确定（见图5）

从图5可以看出，随着发酵时间的增加，发酵产物中粗蛋白含量呈现先升后将的趋势，粗蛋白含量最高的发酵时间是72 h，可达到45.39%；继续增加发酵时间，发酵产物中蛋白含量反而降低，且霉味强烈。这是因为在发酵时间不够的情况下，菌体生长不完全，发酵底物没有被微生物完全分解利用，发酵产物中的粗蛋白含量比较低；发酵时间过长，菌体出现自然溶解现象，使得发酵产物质量不高，酸度过大，米曲霉生成大量的孢子使适口性降低，枯草芽孢杆菌生成芽孢，使得粗蛋白含量进一步降低。综合分析我们选择最合适的发酵时间为72 h。

3.6 料水比的确定（见图6）

水分是微生物所必需的基本物质之一，每种微生物都具有最适宜其生长的水分含量，这是因为水是微生物细胞的重要组成部分，是微生物进行代谢活动的介质，同时还参与一部分生化反应。

从图6可以看出，随着料水比的增加，粗蛋白含量先是增加然后逐渐降低，在料水比为1∶3时，发酵产物中的粗蛋白含量达到最高为45.13%，继续增加料水比，发酵产物中蛋白含量呈降低趋势。这是因为当培养基中含水量偏低时，造成基质膨胀度过低，微生物的生长受到抑制，后期由于微生物生长及蒸发造成发酵底物较干，微生物难以生长，粗蛋白含量不会很高；当培养基中含水量偏高时，会导致基质多孔性降低，发酵物黏度过大，减少基质内气体的体积和气体交换，难以通风、降温，微生物生长受到抑制，发酵产品的粗蛋白含量降低。所以最终选择料水比为1∶3。

3.7 氮源（尿素）添加量的确定（见表1）

本试验中的银杏叶渣其氮含量较低，并且组分多为不溶性的碳水化合物，由于发酵底物自身原因的限制，在试验和实际生产中如果不添加一定的氮源，很难满足微生物生长的需要，同时也无法达到生产蛋白饲料的要求。根据以往相关试验的经验，我们选择了尿素和硫酸铵分别作为氮源进行对比试验，每种氮源的添加比例分别为3%、5%、8%、10%和12%。

表1 不同氮源及添加量对发酵产物粗蛋白的影响（%）

由表1我们可以看出，尿素和硫酸铵两种氮源对发酵产物粗蛋白含量都能提高，在相同情况下尿素对发酵产物粗蛋白含量的增幅高于硫酸铵。在尿素添加量为8%时，发酵产物中粗蛋白含量可达45.69%；在硫酸铵的添加量在12%时，发酵产物中粗蛋白含量可达45.02%。

同时我们还能看出，随着尿素添入比例的增加，发酵产物粗蛋白含量，先升高，随后又有降低的趋势。归其原因，在于尿素的添加在一定程度上弥补了发酵底物中氮含量的不足，促进微生物生产，但是随着尿素添加量的增加，尿素的利用率下降，未被利用的尿素游离出的铵离子改变了发酵环境中pH值，最终影响微生物的正常生长。同时尿素添加量超过8%，发酵产物含有一定的氨气味道，随着添加比例的增加，气味逐渐变强，严重影响牲畜的适口性。在氮源的添加问题上，尿素的添加量要比硫酸铵较少，而且尿素的成本要小于硫酸铵，同时硫酸铵含氮量较低，过量的使用会使硫酸根离子过多，使得培养基偏酸性，这对于发酵是不利的。所以出于经济效益上、微生物有利生长及发酵产品适口性三方面的综合考虑，我们选择尿素为固体培养基发酵时添加的唯一氮源，并且添加量为8%。

3.8 固态发酵产物成分分析

在确定的发酵工艺下，发酵产物呈现褐色，浓密状，有浓郁的醇香味，无霉味，含水量约为10%。测定发酵产物各成分含量并与原料比较结果见表2。

表2 发酵产物成分分析（%）

4 结论

通过对银杏叶渣的发酵工艺条件的研究，最终确定的最佳工艺条件是：热带假丝酵母、米曲霉、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的接种比例为2∶2∶1∶1，接种量 10%，添加尿素8%，料水比1：3，发酵温度30℃，发酵时间72 h。由发酵产物检测结果可以看出，发酵产物的主要营养成分较原料有明显提高，粗蛋白含量由8.41%提高至45.69%，提高了443.28%，粗脂肪含量由8.74%提高至10.25%，提高了17.28%，粗灰分含量由16.91%提高至23.91%，提高了41.40%，粗多糖含量由2.45%提高至3.67%，提高了49.80%，粗纤维由17.24%降低至8.13%，降低了52.84%。银杏叶渣经固态发酵，粗蛋白、粗脂肪、粗多糖等主要成分含量显著提高，营养价值增加。

该生产工艺解决了林业产品加工废弃物银杏叶渣浪费和对环境污染的问题，为畜牧业的发展提供了新型微生物发酵蛋白饲料，该工艺简单易行、便于操作，降低了生产成本，提高了经济效益，有广阔的应用前景。