MEF2A基因多态性位点及其冠心病相关性

黄新次

武汉市普爱医院检验科，湖北武汉 430033

据不完全统计在2013年全球共有超过1500 万人死于冠状动脉粥样硬化心脏病[1]。既往研究发现冠心病的危险因素众多包括血脂代谢、高血压、高血糖、肥胖、吸烟、高尿酸血症等等[2]。近几年来随着分子遗传学的高速发展,学者们发现基因多态性与冠心病有密切的联系[3]。因此笔者拟收集该院心血管内科100 例诊断为冠状动脉粥样硬化心脏病的病人作为研究组，同期100 例来该院进行健康体检未患冠状动脉粥样硬化心脏病的正常人作为对照组，收集时间为2011年4月—2014年4月，目的为调查冠状动脉粥样硬化心脏病的病人与健康人群中9、11 号外显子多态性位点（891C/T 中TT、CT；1294～1296CCG 中DD、DW；1305G/A中AA、GA）中的突变频率。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集该院心血管内科100 例诊断为冠状动脉粥样硬化心脏病的病人作为研究组，同期100 例来该院进行健康体检未患冠状动脉粥样硬化心脏病的正常人作为对照组。研究组，平均年龄（45.2±6.9）岁，其中男性55 人，女性45 人；对照组，年龄（47.1±5.5）岁，其中男性60 人，女性40 人。2 组人员性别，年龄差异无统计学意义。所有研究对象均签定知情同意书。

1.2 入选标准

入选标准：①就诊时临床资料、治疗经过完整。②冠状动脉粥样硬化心脏病的诊断符合中华医学会心内科学分会关于冠状动脉粥样硬化心脏病的诊断与鉴别诊断[4]。③每个研究对象能自愿参与该次研究。

1.3 排除指标

①入院时生命体征不平稳的患者。②有各种急性、慢性感染,严重肝、肾功能不全,恶性肿瘤,自身免疫性疾病者，药物有过敏、恶性心律失常者。③对照组中患有冠心病、或有冠状动脉粥样硬化心脏病家族史。

1.4 研究方法

1.4.1 主要试剂 TaqDNA 聚合酶；EZNA 胶回收试剂；DTCS StartDNA 试剂盒。

1.4.2 仪器与材料 PCR 仪器、垂直电泳槽及电泳仪(上海精密仪器有限公司)、凝胶成像仪、TICK400-测序仪、日本岛津UV265 紫外分光仪。

1.4.3 引物和探针 引物由日本TEIL 杭州生物公司合成,引物序列参考Lusis AJ 等[7]的研究,其余引物用FACE-maker 软件自行设计。

1.4.4 DNA 提取 用EDTA 抗凝收集研究对象外周血5 mL，采用盐析法提取基因组DNA。

1.4.5 PCR 扩增 使用40 μl 反应体系,PCR 缓冲液,NaCl 为2.0 mmol/L,1 μmol/L 上下游引物,0.2 mmol/LdNTP,Taq DNA 聚合酶0.8 U。循环参数如下:5 min 94 ℃预变性,退火20 s,72 ℃延伸20 s,循环40 次。从基因组DNA 中扩增MEF2A 基因的外显子。

1.4.6 SSCP 分析 8 μlPCR 扩增产物和2 μl 缓冲液混合,先96 ℃加热10 min 后立即冰浴,上样于聚丙烯酰胺凝胶,240 V 电泳3 h,银染。

1.4.7 DNA 测序 PCR 产物全部上样琼脂糖凝胶，用E·EZNA 胶回收试剂纯化产物。PCR 正向、反向引物扩增,进行核苷酸序列测定,最终数据用DNA 分析软件比对,并用Chromas 软件测定序列变异。

1.5 统计方法

将资料录入SPSS18.0 软件。计数资料采频数描述，用χ2检验法。

2 结果

2.1 两组人群9、11 号外显子多态性位点的检测

研究组和对照组MEF2A 基因的9 号外显子多态性位点有891C/T 变异，11 号外显子多态性位点有1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T，见图1、图2。

图1 9 号外显子多态性位点

图2 11 号外显子多态性位点

2.2 研究组和对照组9、11 号外显子多态性位点突变频率的比较

研究组与对照组891C/T 中TT、CT 点位突变频率分别为（56%、43%；4%、8%）,差异有统计学意义（P<0.05）;研究组与对照组1294～1296CCG 中DD、DW 点位突变频率分别为（46%、47%；9%、11%）,差异有统计学意义（P<0.05）;研究组与对照组1305G/A中AA、GA 突变频率分别为（51%、37%；6%、7%）,差异有统计学意义（P<0.05）;研究组与对照组1353G/T 中GT、GG 点位突变频率分别为（76%、54%；13%、12%）,差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 研究组和对照组9、11 号外显子多态性位点突变频率的比较

3 讨论

MEF2A 基因广泛在血管平滑肌和内皮细胞中有表达，对冠状动脉的发育起重要作用[5]。有国外学者发现白兔的MEF2A 存在多态性，因此采取基因酶切除法将白兔MEF2A 多态性点位切除，结果显示10 d 后白兔血管异常,肌纤维破裂[6]。因此该研究认为MEF2A 基因结构位点多态性与冠心病可能密切相关。

该研究发现研究组和对照组中MEF2A 基因的9、11 号外显子均存在多态性位点。9 号外显子表明有891C/T 变异，11 号外显子有1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T 变异。但是该研究进一步比较发现：研究组与对照组891C/T 中TT、CT 点位突变频率分别为（56%、43%；4%、8%）,差异有统计学意义（P<0.05）;研究组与对照组1294～1296CCG 中DD、DW 点位突变频率分别为（46%、47%；9%、11%）,差异有统计学意义（P<0.05）;研究组与对照组1305G/A 中AA、GA 突变频率分别为（51%、37%；6%、7%）,差异有统计学意义（P<0.05）;研究组与对照组1353G/T 中GT、GG点位突变频率分别为（76%、54%；13%、12%）,差异有统计学意义（P<0.05）说明891C/T，1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T 点位的变异与冠心病的发病有关。国外同样有报道，9 号外显子表明有891C/T 变异，11 号外显子有1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T变异，与该次研究一致[8]。该研究发现11 号外显子的3 个多态性点位离国际公认的冠心病11 号外显子21 bp 缺失点位非常接近，我们认为可能的原因是MEF2A 基因第11 号外显子中CAG重复序列（重复片段在5～20 个不等）使DNA 聚合酶的在复制阶段产生错误识别,DNA 复制错误,这些错误的片段没有被酶切后，固定在DNA 长链上后，导致第11 号外显子显示多个多态性位点[7]。研究发现MEF2A 基因11 号外显子CAG 下游有脯氨酸重复序列，与冠心病密切相关，而这些重复的脯氨酸重复序列可以导致1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T 点位的变异，与该次研究一致[9]。

综上所述，MEF2A 作为肌细胞增强因子家族的一员，编码转录因子,调节心肌和骨骼肌细胞的增殖、分化和凋亡[10]。笔者认为冠状动脉粥样硬化心脏病的病人MEF2A 基因结构位点891C/T、1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T 点位突变频率明显高于正常人，MEF2A 基因多态性与冠心病明显相关。

[1]Dodou E,Sparrow DB,Mohun T,et al.MEF2 proteins,including MEF2A,are expressed in bothmuscle and non2muscle cells[J].Nucleic AcidsRes,2014,23(4).

[2]YusufS,Reddy S,Tnpuu S,et al.Globalburden ofcardiovascular diseases part I:general considerations,the epidemiologic transition,risk factors,and impact of urbanization[J].Circulation,2011,104(23).

[3]LusisAJ.Atherosclerosis[J].Nature,2012,407(11).

[4]Nora JJ,LortscherRH,SpanglerRD,et al.Genetic2epidemiologic study of early2onset ischemic heart disease[J].Circulation,2013,61(16).

[5]Schildkraut JM,Myers RH,Cupples LA,et al.Coronary risk associated with age and sex of parental heart disease in the Framingham Study[J].Am JCardio,2014,64(9).

[6]Olson EN.Coronary artery disease and the MEF2A transcription factor[J].SciAgingKnowlEnviron,2013,48(2).

[7]Lusis AJ,Fogelman AM,Fonarow GC.Genetic basis of atherosclerosis:part I,new genes and pathways[J]Circulation,2014,110(6).

[8]Lusis AJ,Fogelman AM,Fonarow GC.Genetic basis of atherosclerosis:partⅡ,clinical implications[J].Circulation,2014,110(34).

[9]McKinseyTA,Zhang CL,Olson EN.MEF2:a calcium dependeregulator of cell division,differentiation and death[J].Trends Biochem Sc,i 2002,27(8).

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[11]Black BL,Olson EN.Transcriptional control ofmuscle development bymyocyte enhancer factor22(MEF2)proteins[J].Annu RevCellDev Bio,2013,14(55).

[12]Wang LJ,Fan C,Topol SE,et al.Mutation of MEF2A in an inherited disorderwith features of coronary artery disease[J].Science,2014,302(5).