Photorhabdus luminescens LN2 转座突变菌株的研究

胡素丽，王立婷，丘雪红，颜 珣，张建萍，韩日畴＊＊

(1.石河子大学农学院植物保护系，新疆石河子 832003;2.广东省昆虫研究所，广州 510260)

异小杆属Heterorhabditis 和斯氏属Steinernema昆虫病原线虫分别与发光杆菌属Photorhabdus 和致病杆菌属Xenorhabdus 细菌互惠共生，是国际上新型的高效生物杀虫剂。这类线虫具有杀虫能力强，杀虫谱广，能主动搜索寄主，对人畜、环境安全等优点(Georgis et al.，2006)。昆虫病原线虫之所以能致死昆虫，其体内携带的共生细菌起了关键作 用 (Poinar and Thomas，1966;Poinar et al.，1977)。在昆虫病原线虫的商业化生产过程中，无菌线虫与共生菌组成单菌培养体系，共生菌为线虫的发育繁殖建立理想环境并提供营养。因此，选择合适的共生细菌对这类生物杀虫剂的产业化生产极为重要。

线虫与细菌的共生关系主要体现在4 方面的专化性:信息专化性，即细菌诱导感染期线虫恢复发育的专化性(Han and Ehlers，1998;Strauch and Ehlers，1998;Ciche and Ensign，2003);营养专化性，即细菌将昆虫组织或培养基组分转化为支持线虫生长、繁殖的营养物质的专化性(Akhurst，1983;Sicard et al.，2003;Mitani et al.，2004);定殖专化性，即细菌定殖于感染期线虫肠道的专化性(Han and Ehlers，1998;Martens and Goodrich-Blair，2005;Snyder et al.，2007);种间特异杀线虫专化性，即昆虫病原线虫与非特异共生的共生菌组合培养时，一些共生菌可以产生杀线虫毒素杀死非特异性共生线虫寄主的专化性(Han and Ehlers，1998，1999，2001)。

本文通过构建P.luminescens LN2 的Tn5 转座突变库，获得了可促进H.indica LN2 线虫生长的突变菌株，同时，测定了该突变菌株的菌落特征、对昆虫毒性以及H.bacteriophora H06 线虫的致死作用。

1 材料和方法

1.1 实验昆虫、线虫品系、细菌菌株与质粒

实验采用的线虫品系、细菌菌株和质粒见表1。大蜡螟末龄幼虫由广东省昆虫研究所资源昆虫与生物工程研究中心饲养。

表1 实验线虫品系、细菌菌株与质粒Table 1 Nematode and bacteria strains and plasmids used in this study

1.2 细菌与线虫的培养

Photorhabdus 属细菌及大肠杆菌E.coli 均采用LB 培养基培养，培养温度分别为28℃和37℃。抗生素的使用浓度:卡那霉素(Km)为50 μg/mL、氨苄青霉素(Am)为100 μg/mL、硫酸链霉素(Sm)为50 μg/mL。

H.indica LN2 与H.bacteriophora H06 线虫采用海绵培养基于23℃条件下进行体外培养(Wouts，1981;Han et al.，1992)。无菌的H06 与LN2 感染期线虫分别通过将无菌的H.bacteriophora H06 线虫与非专化性共生的P.luminescens HNA 细菌，H.indica LN2 线虫与非专化性共生的P.luminescens H06 细菌建立单菌组合培养获得(Han and Ehler，1998;丘雪红等，2004)。

1.3 P.luminescens LN2 转座突变子库构建和突变菌株筛选

为了方便检测，本文将pRL1063a 质粒中的luxAB 基因替换成含自身启动子的egfp 基因，构建了重组质粒pRL1063a-egfp。采用三亲本杂交方法，以DH5α/pRL1063a-egfp 为供体菌、DH5α/pRK2013 为辅助菌、P.luminescens LN2-A 为受体，将携带Tn5-egfp 的质粒pRL1063a-egfp 导入LN2-A，于LB 平板(Am，Km)上获得突变菌株约13000 株。

于96 孔细胞培养板的LB 培养基(含1.8%琼脂，加入相应抗菌素)上测定促进LN2 线虫生长的突变菌株(Han and Ehlers，1998)。具体方法如下:将野生型与各突变菌株均匀涂于测定平板中，25℃培养48 h 后，往每个测定孔中加入10 μL 无菌LN2 感染期线虫(150 IJs)，25℃静置培养。每天观察并记录线虫的生长发育情况。每个处理设3 个孔的重复。对于影响线虫生长发育的突变菌株，整个测定至少重复3 次。

1.4 突变菌株LN2-M2716 的Tn5 插入验证

本实验获得影响LN2 线虫生长发育的突变菌株LN2-M2716。采用PCR 与Southern blot 方法验证突变菌株中Tn5 的插入及其拷贝数。即选择在Tn5-lac-egfp 内没有酶切位点的限制性内切酶Spe I 对野生型LN2-W 及突变株LN2-M2716 基因组DNA 及pRL1063a-egfp 质粒进行酶切，其中pRL1063a-egfp 质粒作为阳性对照，野生型LN2-W 作为阴性对照，以Tn5-lac-egfp 内的Km 片段为探针进行Southern 杂交。

1.5 LN2-M2716 的菌落特征

将野生型菌株及突变菌株，涂布在NBTA(Akhurst，1980)和MacConkey 平板上，28℃培养2-3 d，观察菌落的形态、颜色及荧光发生情况。以接种环蘸取于LB 平板上生长了2 d 的菌落，以菌落能否拉丝来判断粘性。

过氧化氢酶活性测定:在灭菌的培养皿中滴加50 μL 3%的H2O2，用接种针挑取固体培养基上的新鲜单菌落，涂布在液体中央，观察是否有气泡出现和气泡出现的强烈程度。

1.6 LN2-M2716 上清液对H.indica LN2 感染期线虫恢复发育的影响

将培养了24 h 的野生型菌株LN2 和突变菌株LN2-M2716 菌液以液体LB 调至OD600后，以1∶100 接入新 LB 液体培基中，28℃，200 rpm 培养24 h 至OD600约为2.0。14000 g，4℃离心10 min，取上清液以0.25 μm 滤膜(Pall 公司)过滤除菌。取48 孔细胞培养板，每孔加入200 μL 上清过滤液，10 μL 无菌LN2 感染期线虫液(150 IJs)，25℃，100 rpm 振荡培养。分别于0，1 d，2 d，3 d，4 d，6 d，8 d 取5 孔的样品于显微镜下观察并记录线虫恢复发育和死亡情况。

1.7 LN2-M2716 对H.indica LN2 线虫生长的影响

测定方法与材料与方法1.3类似，测定板采用48 孔细胞培养板。分别取3 μL 培养了24 h 的野生型菌株LN2-W 和突变菌株LN2-M2716 的菌液涂布相应的测定板中，28℃培养24 h 后，每孔加入10 μL 无菌LN2 感染期线虫液(150 IJs)。加入线虫后的培养板置于25℃培养。培养32 h、68 h、122 h、8 d、12 d 后，以Ringer's 缓冲液(1 L 溶液中含:NaCl 8 g，CaCl20.2 g，KCl 0.2 g，NaHCO30.2 g)冲洗培养基至全部线虫洗出，取样观察线虫生长发育情况。每个处理设5 孔重复。

1.8 LN2-M2716 对H.bacteriophora H06 线虫的毒性

测定方法同1.7。测定菌株除野生型菌株LN2-W 和突变菌株LN2-M2716 外，添加P.luminescens H06 野生菌株作为阳性对照。测定线虫为无菌H.bacteriophora H06 感染期线虫。分别于线虫与细菌共培养2 d、4 d、6 d、8 d 后，以Ringer's 缓冲液冲洗培养基至全部线虫洗出，取样观察线虫存活、生长发育情况。每个处理设5 孔重复。

1.9 LN2-M2716 对大蜡螟的注射毒力

LN2-M2716 菌株以LB 培养至OD600约为2.0，于6000 rpm，10℃下离心10 min 收集菌体，并用无菌PBS (1 L 溶液中含:NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KHPO40.24 g;pH7.4)清洗3 次，最后用PBS 稀释至细菌浓度为10、100、1000、2000 CFU/μL 用于注射大蜡螟。取均重为387 mg 的大蜡螟末龄幼虫，冰上放置5 min后，以10 μL 的注射量将不同浓度的菌液从大蜡螟幼虫的第一对腹足注入昆虫体内，每头昆虫注射10 μL 无菌PBS 作为对照。每重复10 头幼虫，每处理3 个重复。注射后的昆虫置于25℃培养。24 h 后，每6 h 检查昆虫的死亡率，以针刺激昆虫不动为死亡。死亡的昆虫如能变红并发出荧光则认为被共生细菌致死。

1.10 LN2-M2716 对LN2 线虫固体培养产量的影响

为了测定突变菌株对线虫产量的影响，于500 mL三角瓶中加入70 g 海绵培养基(Han and Ehlers，1998)，将7 mL 野生型与突变菌株的24 h培养液分别接入培养基中，摇匀培养基以确保共生细菌均匀分布。培养瓶于23℃培养2 d 后接入3 mL无菌H.indica LN2 感染期线虫液 (3.0×104IJs/mL)。培养8 d，16 d，21 d，26 d，31 d后，分别随机取3 个培养瓶，于0.9% NaCl 溶液中浸泡清洗3 次以上，收集线虫并稀释至合适的倍数，于解剖镜下观察并计数感染期线虫的数量。

1.11 数据统计与分析

百分数值数据均经反正弦变换后，以SPSS16.0 软件进行配对样品t 检验，方差分析P＜0.05 时差异显著。

2 结果与分析

2.1 突变菌株筛选与Tn5 插入验证

利用Tn5-lac-egfp 对P.luminescens LN2 进行随机插入突变，获得13000 个突变株。通过生物测定筛选获得1 个影响线虫生长发育的突变菌株，定名为LN2-M2716。

分别以突变株LN2-M2716 基因组DNA 和pRL1063a-egfp 质粒为模板，以转座子Tn5 内部的序列设计引物 (Tn5-Km-for:5'-ATGATTGAACAAGATGGATT-3'和Tn5-Km-rev:5'-TCAGAAGAACTCGTCAAGAA-3')进行PCR扩增，所得PCR 产物测序结果证实Tn5 已经转座到LN2-M2716 基因组中。

Southern 杂交结果显示，突变株和pRL1063a-egfp 质粒在相应位置各出现了1 条阳性带，而野生型菌没有条带(图1)，表明Tn5 在突变菌株基因组中只有单一位点的插入。

图1 野生型菌株LN2-W 及其突变菌株LN2-M2716 基因组DNA Spe I 酶切后与Km 探针的Southern blot 图谱Fig.1 Southern blotting analysis of wild type strain LN2-W and mutant LN2-M2716 genomic DNA digested by Spe I

2.2 LN2-M2716 的菌落特征

28℃培养36-48 h 后，野生型LN2 菌株和突变菌株LN2-M2716 的菌落在NBTA 平板上呈蓝绿色，在MacConkey 平板上呈红色;黑暗中可见菌落产生强烈荧光;菌落具有较强粘性;过氧化氢酶活性为阳性。说明Tn5 的插入突变没有引起LN2-M2716 的型变(Akhurst，1980)。

2.3 LN2-M2716 菌株对LN2 感染期线虫恢复发育的影响

由图2 可知，LN2 感染期线虫置于野生型与突变菌株培养液的上清过滤液中培养1 d 后开始有少量线虫恢复，培养6 d 后线虫恢复率达到最高值，分别为52%和54%。突变菌株上清过滤液的LN2感染期线虫在各时段的恢复率略高于野生型菌株，但除了第2 d 外，差异不明显。结果表明，Tn5 的插入突变没有影响LN2-M2716 诱导线虫恢复发育的能力。

图2 25°C 培养下H.indica LN2 感染期线虫在P.luminescens LN2 与LN2-M2716 上清液培养的恢复率Fig.2 Infective juvenile recovery of H.indica LN2 recorded after exposure to culture supernatants of P.luminescens LN2 and LN2-M2716 at 25℃

2.4 LN2-M2716 对H.indica LN2 线虫生长的影响

无菌LN2 感染期线虫与不同菌株共培养32 h、68 h、122 h、8 d、12 d 后的生长发育情况见图3。与细菌共培养32 h 后，100%的LN2 线虫已恢复并长至J4，在恢复率上野生型和突变菌株之间没有显著差异。共培养68 h 后，全部LN2 线虫发育至成虫，但在LN2-W 菌株中只有10%的线虫怀卵，而在LN2-M2716 菌株中90% 以上的线虫怀卵，显著高于LN2-W。共培养122 h 后，在LN2-W中，94%的LN2 线虫发育至怀卵成虫;而在LN2-M2716 中，100%线虫已出现下一代幼虫。共培养8 d 后，当LN2-W 中100%的线虫已发育至怀虫阶段时，在LN2-M2716 中已可见大量的第二代幼虫从母体爬出。共培养12 d 后，两种菌株中均已出现第二代线虫，但各龄期线虫的比例不同。在LN2-W 中，近70% J1-J2，约27% IJ，3%J4，未见成虫;在LN2-M2716 中，约18%为J1-J2 龄期，71% IJ，10% J4，0.5%为成虫。培养12 d 后，野生型LN2-W 和突变菌株LN2-M2716的LN2 感染期线虫产量分别为59.8 条/孔和220.4条/孔(图4)。

以上结果表明，突变菌株LN2-M2716 可显著加快线虫的生长发育。

2.5 LN2-M2716 对H.bacteriophora H06 线虫的毒性

LN2 共生细菌对H06 线虫有种间特异的杀线虫作用(Han and Ehlers，1998，1999，2001)。培养2 d、4 d、6 d 后，突变菌株LN2-M2716 中H06 感染期线虫的存活率分别为40%、15%、4%，显著低于野生型菌株LN2-W 中的线虫存活率(分别为63%、39%、18%)。结果表明，LN2-M2716 对H06 线虫的致死活性显著高于野生型。

图3 LB 平板中H.indica LN2 线虫在P.luminescens LN2 和LN2-M2716 菌株中的生长发育情况Fig.3 Nematode development of H.indica LN2 on P.luminescens LN2 and LN2-M2716 growing on LB agar

图4 LB 平板中H.indica LN2 线虫在P.luminescens LN2和LN2-M2716 菌株中培养12 d 后的第二代线虫数量Fig.4 Number of the next generation nematode of H.indica LN2 after 12 days' growth on P.luminescens LN2 and LN2-M2716 growing on LB agar

表2 H.bacteriophora H06 线虫于野生型和突变菌株中的存活率Table 2 The survival rates of H.bacteriophora H06 IJs in wild-type and mutant cultures

2.7 LN2-M2716 对大蜡螟的注射毒力

当注射的细菌浓度为1000 和2000 CFU/μL，24 h 后野生型菌株LN2-W 和突变株LN2-M2716均引起大蜡螟100% 死亡;而注射的细菌浓度为100 与200 CFU/μL、10 与20 CFU/μL 时，则分别在30 h、36 h 后引起100%的大蜡螟死亡率。注射PBS 的对照组中，直至12 d 仍未有大蜡螟死亡。结果表明，野生型菌株LN2-W 与LN2-M2716对大蜡螟注射毒力无显著差异。

2.8 LN2-M2716 对H.indica LN2 固体培养产量的影响

培养8 d、16 d、21 d、26 d 和31 d 时，以突变菌株LN2-M2716 培养的LN2 感染期线虫产量均显著高于以野生型菌株LN2-W 培养的(图5)。培养26 d 时，以两个菌株培养的感染期线虫产量均达到最大值，野生型菌株与突变菌株的线虫产量分别为每克海绵培养基3.5×105IJs 和5.2×105IJs。结果表明，突变株LN2-M2716 显著提高了LN2 感染期线虫的固体培养产量。

图5 LN2-M2716 及野生型LN2-W 菌株中H.indica LN2 线虫的固体培养产量Fig.5 Yields of H.indica LN2 IJs harvested from the solid culture with mutant LN2-M2716 and wild type LN2

3 结论与讨论

昆虫病原线虫与共生细菌之间的共生关系主要表现在食物信号、营养、携菌作用、种间特异的杀线虫作用等方面的专化性(Han and Ehlers，1998，2001;Ciche and Ensign，2003;Martens and Goodrich-Blair，2005;丘雪红等，2010)。本文利用Tn5 转座突变方法构建P.luminescens LN2 细菌的突变体库，筛选影响线虫与细菌共生专化性的突变菌株，获得的突变菌株LN2-M2716 既能促进H.indica LN2 的生长、发育以及感染期线虫产量，又可增强对H.bacteriophora H06 线虫的致死毒性。

这是通过转座突变首次获得可提升感染期线虫产量的突变菌株，对这类生物杀虫剂的产业化和应用意义重大。

在这类线虫的产业化培养系统中，培养时间和产量显著影响昆虫病原线虫的产业化成本。在感染期线虫恢复发育过程中，共生细菌产生的食物信号的诱导是关键一步 (Strauch and Ehlers，1998;Han and Ehlers，1998;Ciche and Ensign，2003)。LN2-M2716 突变菌株对感染期线虫恢复发育无影响。但LN2-M2716 显著促进线虫的生长发育速度并支持高产量的感染期线虫产量，表明Tn5 的插入改变LN2-M2716 的代谢，提高培养基的营养适合性。本文结果为研究共生细菌对昆虫病原线虫的营养作用提供良好的实验材料，为昆虫病原线虫的低成本产业化培养及高效应用提供了有用的菌株，将推动线虫的推广应用。

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