红景天对复合应激因素致慢性疲劳大鼠脾脏质量及NK cell的影响*

王著敏，金 杰

(1.河南省第二人民医院，河南 郑州451191;2.河南中医学院第一附属医院，河南 郑州450000)

慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome，CFS)的长期虚弱性疲劳严重影响患者的日常工作和生活质量。目前CFS的病因不清，临床尚无治疗CFS的有效药物。从目前公认的CFS诊断标准来看，诊断依据主要为患者的主诉，没有客观的体征和实验室检查、影像学资料，较符合中医学审证求因、辨证论治的整体观的认知疾病方式。本实验拟对红景天治疗慢性疲劳大鼠的功能进行初步的研究，从心理—免疫调节角度观察红景天对慢性疲劳大鼠的影响，为今后进一步阐明红景天治疗CFS的作用机制及其在临床中的应用提供实验依据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

雄性SD大鼠40只，体质量(200±20)g，由河南省动物实验中心提供，动物质量合格证号:SYXX(豫)2005－0012。大鼠自然进食、饮水，饲养在正常光照、室温(20±2)℃、相对湿度40%的环境中，5只/笼。适应5 d后，称量大鼠体质量，按数字表法分为正常对照组、模型对照组、红景天组、归脾丸组4组，每组10只。

1.2 药品、试剂与仪器

圣地红景天(诺迪康胶囊)为西藏红景天药业股份有限公司产品，国药准字 Z10980020，批号060403，规格0.28 g/粒。归脾丸为河南省宛西制药股份有限公司产品，国药准字 Z41021897，批号060802，每8丸相当于原药材3 g。NK cell免疫组织化学试剂盒、正常封闭血清和DAB显色试剂盒，均购自武汉博士德生物工程有限公司;Elivision plus试剂盒购自福建迈新生物技术开发有限公司，批号kit5901。BS210s型电子天平，d=0.001 g，Sarlorius公司产品;DS－671型电子天平，上海寺冈电子有限公司产品;CRM440型切片机，日本樱花公司产品;BX51型万能显微镜，日本Olympus公司产品;SSCDC483P型图像采集系统，日本Sony公司产品;Image－proplus 6.0图像分析软件系统，美国 Media Cybernetics公司产品;束缚筒，自制，管状，长18 cm，内径5.8 cm，筒前端有1个内径1.8 cm的通气口;自制敞箱，80 cm×80 cm×33 cm，周壁为黑色，底面用蓝线划分为面积相等的25个方块。

1.3 模型的建立

冷水游泳:大鼠游泳时水深36 cm(游泳池规格80 cm×50 cm×50 cm)，水温(16±1)℃，时段不定，每次游泳持续7 min。束缚操作:大鼠头向通气口置入自制束缚筒后，抵住其后端，限制其活动，每次束缚30 min。

造模之日起，除正常对照组外，其余3组单号日期进行冷水游泳，双号日期进行夹尾激怒(每次夹尾30 min)，并每日进行束缚。造模时间为21 d。在整个造模过程中，正常对照组与其余3组处于同一环境中。

1.4 给药剂量与方法

从造模之日始，正常对照组给予普通饲养;模型对照组按3 mL/只给予生理盐水灌胃;红景天组按168 ng/(g·d)给予圣地红景天混悬液灌胃;归脾丸组按900 ng/(g·d)给予归脾丸混悬液，灌胃。均1 d 1次，连续21 d。

1.5 检测指标

脾脏质量和脾脏NK cell平均光密度值。

1.5.1 取 材

实验结束后，用质量分数100 g/L乌拉坦(400μg/g)麻醉大鼠，在实验室工作台上迅速剖开腹腔，连同周围少量组织一起取出脾脏，浸入生理盐水中洗净附着的血液，剔除残余的周围组织，用滤纸吸干表面水分，放在电子天平上称量质量并记录。取出脾脏中段，置于质量分数100 g/L甲醛溶液中保存。

1.5.2 检测方法

常规制备石蜡切片:①固定脾脏组织块，常规石蜡包埋，4μm切片。②切片用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗。二甲苯(I)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min→1 000 g/L乙醇2 min→950 g/L的乙醇1 min→900 g/L的乙醇1 min→800 g/L乙醇1 min→750 g/L乙醇1 min→蒸馏水洗2 min。③苏木素染色5 min，自来水冲洗。④盐酸乙醇分化30 s(提插数下)。⑤ 自来水浸泡15 min。⑥置伊红液2 min。⑦脱水，透明，封片。950 g/L乙醇(I)1 min→950 g/L乙醇(Ⅱ)1 min→1 000 g/L乙醇(I)1 min→1 000 g/L乙醇(Ⅱ)1 min→二甲苯石碳酸(3∶1)1 min→二甲苯(I)1 min→二甲苯(Ⅱ)1 min→中性树脂封固。

免疫组织化学染色:采用免疫组织化学Elivision法，操作步骤严格按照说明书进行。结果判定:以细胞浆中黄色颗粒为NK cell的阳性表达，以阳性表达区域的平均光密度值表示NK cell表达强度。

计算机图像分析:采用SSC－DC483P图像采集系统，关闭自动白平衡功能，固定光源光圈以统一图像采集条件;先在低倍镜(10×10)下全面观察切片以确定阳性表达区域，然后于高倍镜(10×40)下取5个视野，分别采集图像并保存。采用Image-proplus 6.0软件分析系统测量图像:矫正光密度后于各组图像中各挑选一张典型图片选色及分析测量，并按其操作程式编制各组宏，运行各组宏批量分析各组图片，测量平均光密度值，该值代表NK cell表达强度。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠脾脏质量对比

与模型对照组对比，正常对照组、红景天组、归脾丸组大鼠脾脏质量增加，差别有统计学意义(P＜0.01)。与正常对照组对比，红景天组脾脏质量减轻，差别有统计学意义(P＜0.05);归脾丸组脾脏质量减轻，差别有统计学意义(P＜0.01)。与归脾丸组对比，红景天组脾脏质量增加，但差别无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠脾脏质量对比 ±s

表1 各组大鼠脾脏质量对比 ±s

注:与正常对照组对比，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01;与模型对照组对比，##P ＜0.01。

/g正常对照组 10 1.94 ±0.18组 别 动物数 脾脏质量##模型对照组 10 1.02 ±0.42＊＊归脾丸组 10 1.43 ±0.20＊＊##红景天组 10 1.63 ±0.39*##

2.2 各组大鼠脾脏NK cell阳性表达测定结果对比

与模型对照组对比，正常对照组、红景天组、归脾丸组NK cell平均光密度值减小，差别有统计学意义(P＜0.01)。与正常对照组对比，红景天组NK cell平均光密度值增高，差别有统计学意义(P＜0.05);归脾丸组NK cell平均光密度值增高，差别有统计学意义(P＜0.01)。与归脾丸组对比，红景天组NK cell平均光密度值降低，差别有统计学意义(P ＜0.01)。见表2。

表2 各组大鼠脾脏NK cell阳性表达测定结果对比

3 讨论

免疫功能异常包括自然杀伤(NK)细胞介导细胞毒活性降低，淋巴细胞对致有丝分裂原反应减弱和生成的细胞因子改变，以及单核细胞吞噬作用减弱;因此，也称该病为慢性疲劳免疫功能障碍综合征。

NK细胞是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞，在脾内占3% ～4%。NK细胞的功能主要有自然杀伤活性，靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包括部分细胞系)、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等，杀伤介质主要有穿孔素、NK细胞毒因子和TNF等;因此，NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素，也参与第Ⅱ型超敏反应和移植物抗宿主反应［1－2］。

慢性应激诱导机体自由基代谢异常，过量的自由基聚集，促进脂质过氧化，损伤淋巴细胞DNA，进而抑制免疫功能，破坏免疫器官(脾)［3］。NK是机体极为活跃的免疫调节因素，在调节机体免疫应答中起重要作用。本实验结果显示:慢性疲劳模型动物免疫调节网水平较正常动物明显降低。模型对照组的脾脏质量、脾脏NK细胞阳性表达与正常对照组对比，差别均有统计学意义(P＜0.01)。这些变化可能是慢性疲劳综合征发生的病理机制之一。在增加脾脏质量、脾脏NK细胞阳性表达方面，红景天治疗的作用优于归脾丸，说明红景天具有免疫增强和免疫调节作用;这可能是红景天发挥扶正固本、调和阴阳、补益气血功效，治疗慢性疲劳综合征的机制之一。

［1］王胜旺，王福庆.NKT 细胞［J］.上海免疫学杂志，2002，22(3):210－212.

［2］Kuwatani M，Ikarashi Y，IizukaA，et al.Modulation of acute graft-versus-host disease and chimerism after adoptive transfer of in vitro－expanded invariant Valpha14 natural killer T cells［J］.Immunol Lett，2006，106(1):82 －90.

［3］刘继文，袁方，连玉龙，等.慢性应激对大鼠免疫功能损伤机制的实验研究［J］.环境与职业医学，2007，24(6):599－602.