猪精液冷冻保存的剂型及品种效应

刘德玉+杨尚雪+黄明光+李美珍+李珣+潘天彪+黄光云+胡传活

摘要：为了评价细管类型在不同品种公猪精液冷冻中的效果，为猪精液冷冻的实际生产中冷冻细管的选择提供理论依据，试验将长白、大约克与杜洛克3种美系公猪（每品种7头次）精液进行不同细管类型（5.00、0.50、0.25 mL）的分装冷冻，比较各种细管类型下不同品种公猪之间和同一品种公猪不同细管类型精液冻后质量（冻后精子活力、畸形率及顶体完整率）。结果表明，①相同剂型下，除了0.25 mL细管分装时杜洛克公猪冻后精子顶体完整率显著（P<0.05）高于长白公猪外，3种公猪之间在3个指标上差异均不显著（P>0.05）;②3种公猪冻后精子活力最高的剂型均为0.50 mL细管，冻后精子畸形率及顶体完整率最好的剂型均为5.00 mL细管。总之，3种细管类型中，仅0.25 mL剂型存在品种效应，而3个品种公猪却存在着基本类似的剂型效应。

关键词：猪;精液;冷冻保存;剂型;品种

中图分类号：S828        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）20-4917-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.038

Effects of Package Type and Breed on the Cryopreservation of Boar Semen

LIU De-yu1，2，YANG Shang-xue3，HUANG Ming-guang1，LI Mei-zhen2，LI Xun3，PAN Tian-biao1，

HUANG Guang-yun1，HU Chuan-huo3

（1. Guangxi Institute of Animal Sciences/Guangxi Key Laboratory of Livestock Genetic Improvement， Nanning 530001， China; 2. Guangxi Work Station of Livestock & Poultry Breed Improvement， Nanning 530001， China; 3. College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning 530005， China）

Abstract： To evaluate the effects of straw type on cryopreservation of semen from various breeds of boars and provide a theorectical reference for choosing one suitable straw in production practice of frozen semen， the semens of three kinds of American-derived boar （Landrace， large Yorkshire and Duroc） were packed / frozen with three different types of straws including 5.00 mL， 0.50 mL and 0.25 mL. Each breed had seven samples of semen. The evaluation indexes were made up of the sperm motility， abnormality and acrosomal integrity after frozen among three breeds and straw types. The results showed that for the same straw type， there had no significant differences（P>0.05） among the three breeds except from the acrosomal integrity of Duroc boar at 0.25 mL package significantly higher than that of Landrace boar（P<0.05）. For three breeds， the package type with the highest sperm motility was at 0.50 mL straw. And at 5.00 ml straw， the abnormality and acrosomal integrity was the best. It is indicated that there had breed effect only in the 0.25 mL straw type and while it showed analogous package-type effect in the three breeds.

Key words： boar; semen; cryopreservation; package type; breed

早期的猪精液冷冻技术研究中，猪精液采用玻璃瓶或玻璃试管和较高浓度的甘油溶液进行冷冻保存。后来，牛的粒状干冰法被应用到猪上，把甘油溶液浓度降到1%～3%，可以实行快速冷冻降温操作[1]。随后，猪精液冷冻技术又采用多种分装方式，有5.00 mL大型细管、5.00 mL不同类型的塑料袋、4.00～5.00 mL铝袋、1.70～2.00 mL扁平细管、0.50 mL中型细管以及0.25 mL微型细管，但不同的分装方式冻后精液质量不尽相同。目前，尚未有研究小组将常用的冷冻分装方式在相同的条件下进行系统的比较，以确定较优的承载工具，为实际的冻精生产中承载工具的选择提供有价值的理论依据。基于细管法是新近发展起来的冷冻方法，采用细管法便于保存，有助于提高精液的利用率，本试验试图比较众多的冷冻保存承载工具中细管剂型（5.00、0.50、0.25 mL）对猪精液冻后质量的影响，从而为猪冻精的实际生产中细管剂型的选择提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  试剂及样品  葡萄糖由天津市科密欧化学试剂有限公司提供，柠檬酸由国药集团化学试剂有限公司提供，三羟甲基氨基甲烷（Trishydroxymethylaminomethane， Tris）、N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine， NAC）、青霉素与链霉素由北京索莱宝科技有限公司提供，甘油由汕头市西陇化工厂有限公司提供，卵黄取自南宁市富凤农牧有限公司生产的初产鸡蛋，0.25、0.50及5.00 mL塑料细管由Minitube公司提供。

新鲜精液用手握法采自广西科达畜禽改良有限责任公司饲养的健康、性欲旺盛的美系长白、大约克及杜洛克种公猪，每品种采集7头次，收集富含精子段的精液于预温的洁净烧杯中，1 h内送达实验室。先用8层纱布过滤，然后检查精子活力、畸形率及密度。活力>0.7，畸形率<20%的精液继续用于后续试验。

1.1.2  主要仪器  冰箱（Haier集团）、移液枪（Eppendorf）、相差显微镜（Olympus）、离心机（上海安亭科学仪器厂）、电子恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）、程序降温仪（IMV卡苏公司）。

1.2  方法

1.2.1  精液冷冻-解冻程序  10层纱布包裹精液，置于室温下缓慢降温，然后与稀释液[2]（表1）等温混合（稀释比为1∶2，即先加入1份稀释液，混合均匀，室温下平衡15 min后，再加入另1份稀释液）。分别以0.25、0.50及5.00 mL塑料管分装，10层以上纱布包裹，置于冰箱内5 ℃平衡4 h。

取出塑料管，检查平衡后活力合格待放入程序降温仪冷冻（5～-5 ℃，3 ℃/min;-5～-42 ℃，100 ℃/min;-42 ℃～-140 ℃，30 ℃/min;最后停留2 min），完成后取出塑料管迅速投入液氮中。解冻时，从液氮中取出塑料管，迅速投入37 ℃水浴30～60 s。

1.2.2  精液冻后质量评估

1）活力。从解冻后的精液抽取5 μL滴于载玻片上，加盖玻片后在相差显微镜下观察5个视野，每个视野至少200个精子。

2）畸形率及顶体完整率。参考Zou等[3]的方法染色后于相差显微镜下观察，每个处理制片2张，每片至少统计200个精子。

1.2.3  试验设计  试验按塑料管容量分5.00、0.50、0.25 mL 3个组，每个品种重复7次。

1.2.4  数据处理  所得数据均以平均值±标准差表示，并用SPSS软件处理，分别进行相同剂型3种公猪之间和同种公猪不同剂型之间3个指标的差异显著性分析。

2  结果与分析

2.1  相同剂型下3种公猪精液冻后质量的比较

从表2可知，除了0.25 mL细管分装时杜洛克公猪冻后精子顶体完整率显著（P<0.05）高于长白公猪外，相同剂型下3种公猪之间在冻后精子活力、畸形率及顶体完整率上差异均不显著（P>0.05）。

2.2  同种公猪下不同剂型精液冻后质量的比较

从表2可知，在冻后精子活力上，3种公猪均是0.50 mL剂型组最高，虽然在大约克和杜洛克公猪该剂型组与0.25 mL剂型组差异不显著（P>0.05），但显著高于5.00 mL剂型组（3种公猪）及0.25 mL剂型组（长白公猪）（P<0.05）。在冻后精子畸形率上，长白、杜洛克公猪5.00 mL剂型组显著低于0.25 mL剂型组（P<0.05），该2个剂型与0.50 mL剂型组对比或大约克公猪3个剂型之间对比差异均不显著（P>0.05），3种公猪均为5.00 mL剂型组最低。在冻后精子顶体完整率上，3种公猪均为5.00 mL剂型组最高，而且随着剂型变小，顶体完整率有降低的趋势。

2.3  公猪之间较优剂型精液冻后质量的比较

从表2可知，3种公猪冻后精子活力最高的剂型均为0.50 mL，冻后精子畸形率及顶体完整率最好的剂型均为5.00 mL，而且同一指标在不同品种之间均不存在显著差异（P>0.05）。

3  讨论

目前，冷冻时用细管分装牛精液已经比较普遍[4-6]，在猪精液冷冻方面也已经由传统的块状或颗粒型转为细管型[7-10]，但将常用细管的冷冻效果进行对比的报道较少[11]。本试验比较了3种常用细管（5.00、0.50、0.25 mL）应用于猪精液冷冻时的效果，其中包括精子活力、畸形率及顶体完整率等3个能体现冻后精子质量的最基本指标的对比。相同剂型下3种公猪之间精液冻后质量的比较结果表明，除了0.25 mL细管分装时在冻后精子顶体完整率上存在品种效应外，3个剂型在冻后精子活力、畸形率及顶体完整率上均没有品种效应，其原因尚需进一步研究分析。

同种公猪下不同剂型精液冻后质量的比较结果表明，3种剂型中，0.50 mL细管分装的精液冻后精子活力在3种公猪均为最高，5.00 mL细管分装的精液冻后精子畸形率及顶体完整率均最好，提示细管的形状对猪精液冻后质量影响较大，可能由于冻后猪精液解冻时释放潜伏热受表面积/体积的影响，用较大的表面积/体积的载体分装后冷冻，精子形态较好[1]。5.00 mL细管的长度和直径较大，所以其承载的猪精子冻后形态较好，但用其冷冻猪精液在技术上还有一些难点，例如使用大直径细管冷冻，会使冷冻速率变慢，熏蒸时间变长，管内精液异源性更高，导致更高的精子损伤率，不均匀的解冻速率也将导致冻后精子活率降低[1]。本试验结果表明，三种剂型承载的精液冻后精子活力从高到低是0.50、0.25和5.00 mL，这与Bwanga等[12]及Cordova等[13]的研究结果相似;而冻后精子顶体完整率的结果与2个研究小组的研究结果相反，本试验中，5.00 mL承载的精液冻后精子顶体完整率最高，且随着剂型变小，顶体完整率有降低的趋势。这可能是因为试验所使用的冷冻保存稀释液不同，而稀释液所含成分对猪精液冻后质量有很大的影响。其次，稀释的方法不同，本试验将稀释液分两次加入到精液中，但是两次添加的稀释液中均含有甘油，研究显示甘油对精子具有保护作用的同时也有一定的毒害作用[14，15]。再次，本试验所使用的指标测定方法不同，本试验采用考马斯亮蓝染色后在相差显微镜下观察计数，而Bwanga研究小组所使用的方法是署红-苯胺黑染色后电镜下观察。最后，指标测定人员不同可能也是影响试验结果的重要因素。李林林[16]研究发现，颗粒、0.25 mL细管、5.00 mL细管冷冻后精子活力和活率的差异不显著，这与本试验的结果相同（5.00 mL与0.25 mL承载的3种公猪冻后精子活力差异均不显著）。

Watson[17]在总结精液受精力与具备正常功能的活精子数的关系时认为，只有正常功能的精子数达到一定临界值时，精液的受精力才能得到保证。5.00 mL大型细管长度与直径大，便于分装并节约时间，且1支细管就具有1头份的输精剂量，方便输精。0.25 mL小型细管和0.50 mL中型细管，1头份的输精剂量一般需要20～10根细管，因此不利于输精和生产上普遍推广。本试验研究结果显示，5.00 mL细管冻后精子畸形率最低，顶体完整率最高，是3种剂型中更有利于冻精实际生产的细管。但对于5.00 mL剂型冻后精子活力较低的原因还需进一步研究，以便加快其商业应用的步伐。

4  结论

在本试验条件下，冻后精子活力最优的剂型为0.50 mL细管，冻后精子畸形率及顶体完整率最优的剂型为5.00 mL细管。

参考文献：

[1] 朱士恩.猪精液冷冻技术研究[J].猪业科学，2007（5）：44-47.

[2] 胡传活.牛、猪精液冷冻保存技术相关问题的研究[D].南宁：广西大学，2009.

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4  结论

在本试验条件下，冻后精子活力最优的剂型为0.50 mL细管，冻后精子畸形率及顶体完整率最优的剂型为5.00 mL细管。

参考文献：

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4  结论

在本试验条件下，冻后精子活力最优的剂型为0.50 mL细管，冻后精子畸形率及顶体完整率最优的剂型为5.00 mL细管。

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[12] BWANGA C O， BRAGANCA D E， EINARSSON S， et al. Cryopreservation of boar semen in mini-and maxi-straws [J]. Journal of Veterinary Medicine Series A， 1990， 37（9）： 651-658.

[13] CORDOVA A，PEREZ-GUTIERREZ J F，LLEO B， et al. In vitro fertilizing capacity and chromatin condensation of deep frozen boar semen in 0.5 and 5 mL straws[J]. Theriogenoloy， 2002， 57（8）： 2119-2128.

[14] HAMMERSTEDT R A P， ANDRES J C. Metabolic support of normothermia. In： Karow A M， Critser JK （eds）. Reproductive Tissue Banking [M]. San Diego： Academic Press， 1997.

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[16] 李林林.猪精液5 mL细管冷冻保存技术研究[D].四川雅安：四川农业大学，2006.

[17] WATSON P F. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen[J]. Animal Reproduction Science， 2000， 60-61： 481-492.