AgNO3对银杏胚愈伤组织诱导及分化的影响

秦小舒，曹福亮，逯 岩，郁万文，林芳芝

(南京林业大学 森林资源与环境学院，江苏 南京 210037)

银杏(Ginkgo biloba L.)是我国主要经济树种之一，其树、叶、果、皮、花等广泛用于医疗保健与观赏［1］。银杏传统的育种方式周期较长，难以满足优良种质资源的需求，组织培养是实现优良品种快速繁殖的重要途径。其中合子胚因其分化程度低常被用做外植体，银杏心形胚、近成熟胚能诱导出少量不定芽，但芽未能生根［2-3］;未成熟胚能诱导出少量体胚，但各阶段畸形胚比率高，未能成苗［4-5］或少量成苗［6］。提高愈伤组织不定芽或体胚的分化率将加快银杏组培的工厂化育苗进程。研究表明，AgNO3能促进外植体不定芽的分化及体胚的发生，同时显著降低褐化，提高生长量，在组织培养中应用十分广泛［7-9］。目前，国内外关于AgNO3在银杏组培中的应用鲜有报道。本研究将以不同发育时期银杏胚为外植体，初步探讨AgNO3对愈伤组织诱导及分化的影响，以期为建立银杏高效再生体系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试材为江苏泰州大佛指，于2013 年9 月采集并4 ℃低温保存。分别取3 个阶段银杏胚进行研究:(1)10 月16 日胚，早期心形胚至鱼雷形胚，胚长1～2.7 mm(图1:A，B)，接种时取全胚;(2)11 月16日胚，子叶伸长且闭合，稍部尖形，胚长2.5～4 mm(图1:C)，接种时取全胚;(3)1 月3 日胚，子叶外张，胚芽发育基本成熟，胚长＞3.5 mm(图1:D)，接种时取子叶。

1.2 方法

1.2.1 培养基与激素的筛选 采用双因素随机试验。培养基为MS，MT，DCR，外源激素为NAA(0.5，1.0 mg/L)与6-BA(1.0，2.0 mg/L)的组合，共12 个处理。10 月3 日接种，剥去骨质中种皮后，于超净台上70%酒精1 min，10%次氯酸钠15 min 进行消毒。每个处理10 个胚，4 个重复。继代周期20～25 d，下同。

1.2.2 AgNO3对不同时期银杏胚愈伤组织诱导的影响 激素与培养基由上步筛选而出。外植体为3 个时期银杏胚，AgNO3浓度为0，0.1，0.5，1.0，3.0，5.0 mg/L。AgNO3采取过滤方式灭菌。每瓶7个胚，共6 瓶。

1.2.3 隔代添加AgNO3对愈伤组织分化的影响 隔代添加AgNO3的处理方式为第一代添加，第二代不添加，第三代添加，依此类推。外植体为11 月16 日胚，AgNO3浓度为0，0.1，0.5，1.0，3.0 mg/L。每个处理5 瓶，每瓶7 个胚。

1.2.4 AgNO3避光处理对愈伤组织诱导的影响 两种处理方式:处理1 为暗培养，AgNO3与外植体都遮光，外植体为10 月16 日胚，AgNO3浓度为0，0.1，0.3 mg/L;处理2 为添加活性炭，浓度500 mg/L，Ag-NO3处于避光状态，外植体处于光照状态，外植体为11 月16 日胚，，AgNO3浓度为0，0.1，0.5，1.0，3 mg/L。每个处理5 瓶，每瓶7 个胚。

1.3 统计及分析

数据采用Excel2003 与SPSS20.0 进行分析。

2 结果及分析

2.1 培养基和激素的选择

10 月3 日的胚多为心形胚鱼雷形胚，胚较幼嫩，接种后容易失水死亡。接种后3 d 胚体膨大，10 d表皮脱分化形成愈伤组织，胚轴愈伤组织白色半透明，子叶愈伤组织淡黄或翠绿，质地疏松，生长旺盛。由表1 可知，各处理愈伤组织平均诱导率大于60%。双因素方差分析显示:植物生长调节剂NAA(0.5～1 mg/L)，6-BA(1～2 mg/L)对胚愈伤组织诱导影响差异不显著(P＞0.05)。而培养基DCR 与MS、MT 差异显著，MS 与MT 差异不显著(P＜0.05)。MS 与MT 属于高盐培养基，能很好的诱导愈伤组织，诱导率大于88%，DCR 属于低盐培养基，能较好的诱导愈伤组织，诱导率为60%～85%。考虑到愈伤组织的高诱导率会降低外植体对AgNO3的敏感程度，所以选择DCR+NAA1.0 mg/L+6-BA1.0 mg/L为基本培养基进行下一步的研究。

表1 不同培养基和激素对银杏幼胚愈伤诱导的影响Tab.1 Effect of different mediums and hormones on callus induction of ginkgo embryos

2.2 AgNO3对不同时期银杏胚愈伤组织诱导的影响

AgNO3处理下的愈伤组织较对照质地坚硬，色泽更绿，愈伤程度降低，且该趋势随AgNO3浓度的增加而加强。高浓度(3～5 mg/L)处理下，胚只轻微膨大，难以愈伤。3 个时期胚愈伤组织诱导率都随AgNO3浓度的增加先升后降，但其对AgNO3的敏感程度不同:10 月胚的诱导率总体高于11 月胚而低于1 月胚的子叶。

由表2 可知，10 月16 日胚，在AgNO3浓度为1 mg/L 时，诱导率达到最大为87%，浓度0，0.1，0.5，1 mg/L处理之间诱导差异不显著(P＞0.05)，但与3，5 mg/L 差异显著(P＜0.05)。11 月16 日胚，当AgNO3浓度为0.5 mg/L 时，诱导率达到最大为77%，浓度1 mg/L 与0.1，0.5 mg/L 处理之间差异不显著(P＞0.05)，与0，3 mg/L 的处理差异显著(P＜0.05)，而0.1，0.5 mg/L 与0，3 mg/L 处理差异不显著(P＞0.05)。次年1 月2 日胚，子叶为外植体，当AgNO3浓度为0.1 mg/L 时，诱导率最大为98%，浓度在3 mg/L 范围内，各诱导率差异不显著(P＞0.05)。

表2 AgNO3对不同发育期银杏胚的愈伤诱导率影响Tab.2 The effect of AgNO3on embryos callus induction of different stages

图1 银杏愈伤的不同生长现象及分化现象Fig.1 Phenomenon of different growth and differentiation on callus

2.3 隔代添加AgNO3对愈伤组织分化的影响

常规添加AgNO3的处理，只有低浓度0.1 mg/L 出现芽点的分化(图1:F)。浓度升高时，愈伤组织呈墨绿色干枯状，到3 mg/L 时，褐化死亡。隔代添加AgNO3后，愈伤生长发生变化。表现为随着浓度的升高，干枯的愈伤组织变得水润有光泽，且出现了不同的分化。1 mg/L 时，愈伤组织50 d 分化出短细透明丝状物，两瓶共5 块(图1:E);90 d 时1 块愈伤组织分化出6 个类似子叶胚的突出体，并排相连生长(图1:H、I、J)，另有1 块愈伤分化出两片愈伤化银杏叶，色泽淡绿透明，轮廓清晰(图1:G)。浓度为1.5 mg/L时，愈伤组织50 d 分化出透明长丝状物，两瓶共5 块(图1:K)。浓度为3 mg/L 时，50 d 亦有一瓶出现丝状突起，共2 块，另有2 块出现圆球突起并联生长，色泽淡绿透明，表皮光滑有光泽(图1:L);在90 d 时，分化出短小叶状突起，干褐(图1:M)。

2.4 避光处理对AgNO3作用的影响

对AgNO3采取两种遮光方式，结果出现差异。暗处理中，由表3 可知各浓度AgNO3对愈伤的诱导率及愈伤程度影响差异不显著(P＞0.05)，均在80%左右，诱导率高于光照培养，愈伤程度基本相同。其中，未添加AgNO3的处理愈伤组织较大且疏松，呈现出透明愈伤包裹黄色愈伤的特点(图1:O)。添加AgNO3的处理中愈伤稍小，黄白透明，表面有毛状突起。

在活性炭处理中，胚轴形成愈伤而子叶只轻微膨大，二者差异明显，能被轻易分开。由表4 可知，添加AgNO3后，胚轴在浓度0.1 mg/L 与0.5 mg/L 出现白色透明细腻愈伤组织(图1:N)，该组织对外界环境敏感，如不及时继代(15 d)，则比普通愈伤褐化死亡快，其诱导率随Ag+浓度升高而降低，高浓度(≥1 mg/L)AgNO3显著抑制其诱导，当浓度为3 mg/L 时，胚难以诱导出愈伤，进而萌发出正常银杏苗。

表3 暗培养愈伤诱导的影响Tab.3 The effect of dark cultivation on callus induction

表4 活性炭对愈伤诱导的影响Tab.4 The effect of AC on callus induction

3 结论与讨论

银杏快繁，面临着分化率低、生根困难和褐化严重3 个难题［2，10-11］。有研究发现AgNO3可促进外植体分化，控制褐化，抑制黄化。因Ag+与乙烯竞争受体蛋白成为乙烯释放的抑制剂，而乙烯和多胺中的某些胺类竞争底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，含量此消彼长［8，12-13］。封闭的组培瓶中积累大量乙烯，AgNO3能降低乙烯的含量，提高外植体中多胺的合成，而多胺对不定芽和体胚的分化有促进作用［7］。在牡丹组培中，AgNO3可以降低愈伤褐化率，提高组培苗生长质量［14，15］。在中华结缕草茎尖培养中，Ag-NO3可抑制其黄化，促进生长［16］。

本研究表明银杏胚愈伤组织诱导率较高为64%～97%。光照条件下，一定浓度(0～1 mg/L)的AgNO3能提高愈伤诱导率而减缓其增值速度，高浓度(＞3 mg/L)则显著抑制愈伤的诱导。其中，心形胚鱼雷形胚的诱导率低于成熟胚子叶而高于早期子叶胚，可能是心形胚分化程度为三者中最低，其脱分化的能力高于后两者，同时成熟胚子叶的诱导率高于胚轴［6，17-18］，故子叶愈伤诱导率高于全胚。一些研究认为不同发育时期的胚所含激素、内含物的种类和浓度亦会影响愈伤的诱导与分化［19-20］。植物激素可以通过影响多胺［12］或DNA 甲基化水平来调节植物的生长发育［21］。

本研究发现培养方式对愈伤组织的诱导及分化产生了不同影响。持续添加AgNO3时，只有低浓度处理(0.1 mg/L)分化出芽点，高浓度处理则褐化死亡，Ag+属于重金属，能竞争性的进入叶绿素分子，长期添加导致外植体Ag+中毒，这与Haeyoung 等［22］在甘蓝体胚实验中的发现一致。隔代添加AgNO3能降低Ag+的毒害作用，增强愈伤对高浓度AgNO3的适应能力，且促进愈伤组织分化:1 mg/L 处理分化出丝状物、叶片和胚类似物，1.5 mg/L 处理分化出长丝，3 mg/L 处理分化出叶片和球状物，但分化比例较低。愈伤组织从启动分化到形成不定芽或体胚是个复杂的过程，如果分化停滞于中间某个过程，仅凭外部形态的变化来判断具有一定的局限性，在研究中常借助于细胞组织学手段进行观察。吴元立等［23］通过石蜡切片发现成熟银杏胚25 d 左右便能形成胚性细胞，最后可发育至心形胚。盛丽莉等［24］发现银杏小子叶胚能形成胚性愈伤，最后发育至球形胚。本研究中的胚类似物只在一块愈伤组织上出现，具有偶然性，但通过上述二人的石蜡切片观察可知，银杏幼胚具有诱导胚性愈伤的潜能，本研究中只给出了一种培养基和激素组合，没能满足后续培养中适宜的分化条件而使分化终止。银杏组培中，对处于某一发育阶段但尚未取得突破的愈伤组织或外植体，可利用现有的干燥冷冻技术进行保存，以利于后续研究［25-26］。

AgNO3在光照下分解为单质Ag 和气体NO2、O2。本研究对AgNO3进行遮光处理发现，暗培养时，愈伤组织诱导率提高，AgNO3不能对诱导产生显著影响。可能是遮光处理显著增加了愈伤组织诱导率及生长量，此增长大过了Ag+减缓愈伤生长的能力。而活性炭处理的全胚中，胚轴在低浓度(0.1～0.5 mg/L)处理下形成愈伤组织，子叶只轻微膨大。有学者认为胚轴比子叶对AgNO3更敏感［8］。胚轴愈伤与膨大子界限明显，如选用小体积胚的胚轴作外植体时，添加活性炭培养可轻易将胚轴与子叶分开。本研究认为活性炭对AgNO3的吸附量少，且提供的遮光环境降低了AgNO3的分解程度，以致增强了对外植体的作用。在含活性炭的培养基中添加AgNO3应比光照下适当降低浓度。

建立完善的银杏快繁体系还面临着众多难题。AgNO3能促进银杏幼胚愈伤组织的诱导和分化，且隔代添加的方式提高了外植体对AgNO3的适应能力，如在此基础上，研究培养基、外源激素和培养环境对幼胚愈伤组织分化的影响，将会丰富银杏再生体系的理论依据。

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