唑虫酰胺对小菜蛾的亚致死效应研究

陈洁琼，江 瑛，陈 琼，黄水金*，李保同

(1.江西农业大学 农学院，江西 南昌 330045;2.江西省农业科学院，江西 南昌 330200)

小菜蛾(Plutella xylostella)属于鳞翅目菜蛾科，是世界性的十字花科蔬菜主要害虫［1］。由于其年发生代数多，繁殖系数高，危害极为严重。化学药剂一直是防治小菜蛾的主要手段，由于长期的不合理用药，导致抗药性十分严重，如对氯虫苯甲酰胺等均产生了较高的抗性水平［2-3］。唑虫酰胺(tolfenpyrad)为新型吡唑杂环类杀虫杀螨剂，其作用机理为阻碍线粒体代谢系统中的电子传递系统复合体I，从而使电子传递受到阻碍，使昆虫不能提供和贮存能量，被称为线粒体电子传达复合体阻碍剂(METI)［4］。该药剂对多种螨类以及鳞翅目、半翅目、膜翅目、双翅目和缨翅目害虫均有效，特别是对小菜蛾、蓟马和茶叶小绿叶蝉有特效［4］。目前，尚未见田间害虫对唑虫酰胺产生抗性的报道。已有研究表明，大田使用杀虫剂除可直接杀死靶标害虫，其在环境中的毒力随着时间的延续会逐渐递减到亚致死剂量，可能造成昆虫生态行为、生殖力、发育历期和抗药性的变化［5-7］。随着唑虫酰胺的广泛应用，其对害虫的选择压力也将随之增大，施用后同样可能存在田间亚致死效应。为此，笔者研究了唑虫酰胺对小菜蛾3 龄幼虫的亚致死效应，旨在为唑虫酰胺的合理应用及小菜蛾的综合治理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试昆虫 供试小菜蛾采自江西省南昌县郊区菜地，幼虫参照蛭石萝卜苗法［8］饲养。幼虫化蛹后，转至25 cm×15 cm×25 cm(长×宽×高)的养虫纱笼内羽化，笼内放置沾有10%蜂蜜水的棉球供成虫取食，以及1 盆高约10 cm 的新鲜萝卜苗供其产卵。每天更换新鲜萝卜苗并补充糖水，将带卵萝卜苗放入60 cm×30 cm×25 cm(长×宽×高)的养虫笼内孵化和饲养。

1.1.2 供试药剂、试剂及仪器 15%唑虫酰胺水乳剂(江西正邦生物化工股份有限公司技术部配制)，α-乙酸萘酯(α-NA，广州齐云生物技术有限公司，分析纯)，固蓝RR 盐(南京生工进口分装)，对硝基苯甲醚(β-NA，瑞士Adamas-beta 公司，分析纯)，还原型辅酶Ⅱ(NADPH)(Roche，进口分装)，牛血清白蛋白和考马斯亮蓝G-250(上海蓝季科技发展公司)，苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫代苏糖醇(DTT)、苯基硫脲(PTU)、2，4-二硝基氯苯(CDNB)、还原性谷胱甘肽(GSH)均为国产分析纯。UV9100 型紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 生物测定 毒力测定采用浸叶法［9］:取新鲜甘蓝叶片，清洗擦拭干净后，用打孔器打成直径约6 cm的圆片，分别置于用水稀释的系列浓度的药液中，浸渍10 s 后取出，晾干，放入φ7 cm 的培养皿内，每皿接入小菜蛾3 龄中期幼虫10 头，置于温度(25±1)℃、相对湿度65%±5%、光周期14L:10D 的人工养虫室中饲养。每处理重复4 次，并设清水作对照。每隔24 h 观察记录试虫死亡情况，并于处理后72 h统计死亡率，计算毒力回归方程、LC30和LC50。

1.2.2 生物学特性观察 按毒力回归方程计算的LC30和LC50值配制唑虫酰胺药液，参照1.2.1 方法对小菜蛾3 龄中期幼虫进行药剂处理和饲养，处理后72 h 将存活幼虫转入无毒的新鲜甘蓝叶片上继续饲养。每处理重复10 次，并设清水处理作对照。对药前和药后72 h 的幼虫以及化蛹当日的蛹称量，以后每隔24 h 观察记录幼虫发育进度与死亡、幼虫化蛹与蛹期及成虫羽化情况。将相同浓度同日羽化的雌雄成虫放入口径为7 cm 的一次性塑料杯内配对产卵，杯中放置一小团浸有10%糖水的棉球为成虫补充能量，每个处理配对20～30 对，每天更换棉球并记录成虫寿命和产卵数量。

1.2.3 幼虫体内解毒酶活性测定 按毒力回归方程计算的LC30和LC50值配制唑虫酰胺药液，参照1.2.1方法对小菜蛾3 龄中期幼虫进行药剂处理和饲养，分别测定处理后24，48，72 h 存活幼虫体内解毒酶活性。

酶原制备:①酯酶:挑选5 头幼虫，加入1 000 μL 磷酸缓冲液(0.1 mmol/L，pH=7.0，含0.1%TritonX-100)冰浴匀浆2 min。②谷胱甘肽-s-转移酶:挑取5 头幼虫，加入1 000 μL 磷酸缓冲液(0.1 mmol/L，pH=7.0，含1 mmol/L EDTA)冰浴匀浆2 min。③多功能氧化酶:挑取5 头幼虫，加入1 100 μL磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH=7.8，含1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PTU 和1 mmol/L PMSF)冰浴匀浆2 min。将匀浆液于4 ℃10 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液在4 ℃12 000 r/min条件下离心30 min，最后所得上清液作为酶原备用。

酶活性测定:①酯酶:于比色皿中依次加入2 000 μL 底物与显色剂的混合液(含2.1 mmol/Lα-NA和2.1 mmol/L 固蓝RR 盐)，900 μL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液和100 μL 酶液(稀释10 倍)，混匀，27 ℃温育5 min 后，置于分光光度计450 nm 波长下测定光密度值。②谷胱甘肽-s-转移酶:于比色皿中加入900 μL 0.1 mol/L 的磷酸缓冲液，1 000 μL 6 mmol/L GST 和1 000 μL 1.2 mmol/L 的CDNB，最后加入100 μL酶液(稀释10 倍)，混匀，27 ℃温育5 min，置于分光光度计340 nm 波长下测定光密度值。③多功能氧化酶:于比色皿中加入1 000 μL 2 mmol/L p-NA，100 μL 9.6 mmol/L NADPH 和900 μL 酶液，混匀后置于分光光度计405 nm 波长下测定光密度值。

蛋白质含量测定:参照Bradford［10］考马斯亮蓝G-250 法，以BSA 作标准曲线。

1.2.4 数据分析 毒力回归方程、LC30和LC50值以及LSD 多重比较均使用SPSS 17.0 软件进行计算与分析。

2 结果与分析

2.1 唑虫酰胺对小菜蛾的毒力

根据生物测定结果，利用机率值分析法建立的唑虫酰胺对小菜蛾的毒力回归方程为y=2.727 4+2.185 9x，R2=0.964 3，LC30值为6.306 1 mg/L，LC50值为10.955 5 mg/L(95% 置信限为8.956 3～13.416 2 mg/L)。以此LC30和LC50值作为以下研究的药剂亚致死浓度。

2.2 唑虫酰胺亚致死浓度对小菜蛾幼虫体质量及蛹质量的影响

参试的不同处理组幼虫的初始体质量无显著性差异，而处理后72 h 不同处理组存活的幼虫体质量存在差异(表1)。其中，CK 组的幼虫体质量最大，平均为3.08 mg/头，分别为LC30和LC50处理组幼虫体质量的2.5 倍和2.9 倍，均显著高于2 个药剂处理组。CK 组的雌雄蛹质量分别为5.18 mg/头和6.13 mg/头，均明显高于2 个用药处理组。同时，高浓度药剂处理组幼虫体质量和蛹质量均低于低浓度药剂处理组，但彼此间差异不显著。由此表明，唑虫酰胺亚致死浓度可显著降低小菜蛾幼虫和蛹的体质量。

表1 亚致死浓度唑虫酰胺对小菜蛾幼虫体质量及蛹质量的影响Tab.1 Effects of sublethal concentration of tolfenpyrad on the body mass of larval and pupal of Plutella xylostella(L.)

2.3 唑虫酰胺亚致死浓度对小菜蛾生长发育及繁殖的影响

药剂处理后，小菜蛾幼虫和蛹的发育历期显著延长，其中LC30和LC50处理组从3 龄幼虫发育至4 龄幼虫的时间分别延长0.46 d 和0.56 d(表2)，用药后小菜蛾3 龄至蛹发育历期可以看出，唑虫酰胺亚致死浓度处理小菜蛾3 龄幼虫，对其幼虫和蛹的发育有显著的迟滞效应。同时，唑虫酰胺亚致死浓度可显著降低幼虫化蛹率、成虫羽化率、成虫寿命和成虫单雌产卵量，

LC30和LC50处理组的化蛹率分别为77.60%和73.82%，明显低于未用药对照组(89.21%)，2 个药剂处理组的羽化率亦均明显低于对照组。此外，唑虫酰胺还影响小菜蛾成虫寿命，LC30和LC50处理组的成虫寿命均显著短于对照组的成虫寿命。

从表2 还可看出，药剂处理组的单雌产卵量均显著低于对照组，且随着药剂浓度增加而降低。此外，药剂处理组的卵孵化率也明显低于对照组。表明亚致死浓度唑虫酰胺处理对小菜蛾的繁殖不利。

表2 亚致死浓度唑虫酰胺对小菜蛾生长发育的影响Tab.2 Effects of sublethal concentration of tolfenpyrad on the development and reproduction of Plutella xylostella(L.)

2.4 唑虫酰胺亚致死浓度对小菜蛾幼虫体内解毒酶活性的影响

2.4.1 唑虫酰胺对小菜蛾多功能氧化酶活性的影响 药剂处理后24 h，LC30和LC50处理组幼虫的多功能氧化酶活性分别为0.18 OD/(min·mg pro)和0.11 OD/(min·mg pro)，均明显低于CK，且其活性随着唑虫酰胺浓度的提高而降低;药剂处理后48 h 和72 h，LC30和LC50处理组幼虫的多功能氧化酶活性均明显低于CK(图1)。由此表明，小菜蛾3 龄幼虫经唑虫酰胺亚致死浓度处理后，其体内多功能氧化酶活性受到不同程度的抑制。

图1 亚致死浓度唑虫酰胺对小菜蛾多功能氧化酶活性的影响Fig.1 Effects of sublethal concentration of tolfenpyrad on MFOs activity of P.xylostella

图2 亚致死浓度唑虫酰胺对小菜蛾酯酶活性的影响Fig.2 Effects of sublethal concentration of tolfenpyrad on EST activity of P.xylostella

2.4.2 唑虫酰胺对小菜蛾幼虫体内酯酶活性的影响 药剂处理后24，48，72 h，小菜蛾幼虫酯酶活性显著低于CK，其中，LC30处理组小菜蛾幼虫酯酶活性比CK 分别降低32.02%、27.55%和28.28%，但高于LC50处理组(图2)。由此表明，小菜蛾3 龄幼虫经过唑虫酰胺亚致死浓度处理后，其体内的酯酶活性受到不同程度抑制。

图3 亚致死浓度唑虫酰胺对小菜蛾谷胱甘肽-s-转移酶活性的影响Fig.3 Effects of sublethal concentration of tolfenpyrad on GSTs activity of P.xylostella

2.4.3 唑虫酰胺亚致死浓度对小菜蛾幼虫体内谷胱甘肽-s-转移酶活性的影响 药剂处理后24，48，72 h，LC30和LC50处理组的GSTs 酶活性均显著降低(图3)。由此表明，小菜蛾3 龄幼虫经唑虫酰胺亚致死浓度处理后，其体内谷胱甘肽-s-转移酶活性也受到显著的抑制。此外，LC30处理组的GSTs 酶活性波动较大，药后24 h 的GSTs 酶活性显著高于LC50处理组，而药后48 h和72 h 均显著低于LC50处理组(图3)。

3 讨论

亚致死剂量的杀虫剂会显著影响昆虫的生长发育［11-13］。例如，亚致死剂量多杀菌素导致小菜蛾种群的化蛹率和蛹质量显著降低，生殖力显著下降［14］;亚致死剂量氰戊菊酯导致小菜蛾的化蛹率、羽化率和蛹质量明显降低［15］;亚致死剂量氰氟虫腙处理小菜蛾种群后，显著降低其化蛹率、蛹质量和羽化率，明显延长蛹期，缩短成虫产卵期和寿命［16］;茚虫威LC30和LC50以及高效氯氰菊酯LC15、LC30和LC50处理组各虫态发育历期比对照组显著延长，3 龄、4 龄幼虫和蛹的重量均显著低于对照组，茚虫威LC30和LC50以及高效氯氰菊酯LC30和LC50处理组小菜蛾后代的总产卵期显著短于相应对照组［17］;亚致死浓度氯虫苯甲酰胺处理小菜蛾后，显著延长了4 龄至化蛹的历期、显著降低了化蛹率、蛹重和成虫羽化率，延长了成虫的产卵前期［18］。本研究发现，唑虫酰胺LC30和LC50处理后，可延长小菜蛾幼虫和蛹的发育历期，降低化蛹率和羽化率，缩短成虫寿命，减轻小菜蛾幼虫的体质量和蛹质量，且药剂浓度越高幼虫体质量和蛹质量越低，与前人报道的结果相似。由此推测，应用低剂量的唑虫酰胺防治小菜蛾，可能会导致田间小菜蛾种群的世代重叠，对作物的为害时间延长。

本生殖研究结果表明，亚致死浓度唑虫酰胺处理将导致小菜蛾的繁殖力下降，表现为产卵量及卵孵化率的降低。Kamleshk［19］报道亚致死浓度的甲胺磷和甲萘威处理小菜蛾3 龄幼虫后，雌虫的产卵量下降;Mahmoudvand［20］报道亚致死浓度的氟铃脲处理小菜蛾后，其蛹质量、产卵量、净生殖率和内禀增长率显著降低。而Nemoto 等［21］报道用亚致死剂量的灭多威处理小菜蛾4 龄幼虫后，其成虫的繁殖力增强，卵的体积增大，并且卵孵化率明显高于对照;Sotan 等［22］和Fujiwaray 等［23］报道亚致死剂量的氰戊菊酯处理小菜蛾后，使小菜蛾种群的内禀增长率提高，单雌产卵量比对照有所增加。这可能与药剂的种类不同有关，但还需要进一步证实。

酯酶、谷胱甘肽-s-转移酶和多功能氧化酶是昆虫体内3 种重要的解毒酶，在昆虫代谢药物的过程中起着重要的作用［24］。亚致死剂量杀虫剂处理昆虫后，不仅影响其生长发育和繁殖，还将对害虫体内的解毒酶产生诱导或抑制作用［25-27］。梁沛等［28-29］报道亚致死剂量阿维菌素和高效氯氰菊酯处理小菜蛾后，其谷胱甘肽-s-转移酶比对照组分别提高了42%和70%，其羧酸酯酶活性也比对照显著升高;尹显慧等［30］报道敏感种群小菜蛾经亚致死剂量多杀菌素处理后，其羧酸酯酶活性在不同时间段有波动，开始时段比活力增加，随着处理时间的延长，比活力逐渐被抑制，细胞色素P450 酶系的O-脱甲基酶活性具有明显的抑制作用但对谷胱甘肽-s-转移酶有明显的诱导作用。在本研究中发现，唑虫酰胺亚致死浓度LC30和LC50处理小菜蛾3 龄幼虫后，3 种解毒酶活性均明显低于CK 组，表明亚致死剂量唑虫酰胺对小菜蛾幼虫体内的酯酶、谷胱甘肽-s-转移酶和多功能氧化酶活性有显著的抑制作用。在药后24 和72 h，唑虫酰胺LC30处理组的多功能氧化酶活性均高于LC50处理组，而在药后48 h LC30处理组多功能氧化酶活性略低于LC50处理组，说明多功能氧化酶在唑虫酰胺的代谢中发挥了重要作用。本研究中还发现，在药后24、48 和72 h 小菜蛾体内的酯酶活性表现出剂量效应，推测酯酶是小菜蛾对唑虫酰胺解毒代谢的主要酶系，并且可能在小菜蛾对唑虫酰胺的抗药性进化过程中具有极其重要的作用。此外，唑虫酰胺LC30处理组的GSTs 酶活性波动较大，其在药后24 h 的GSTs 酶活性显著高于LC50处理组，而在药后48 和72 h 的GSTs 酶活性均显著低于LC50处理组。这在一定程度上说明谷胱甘肽-s-转移酶可能不是小菜蛾幼虫代谢唑虫酰胺的主要因素，而是小菜蛾在不同程度胁迫下采取的一种生存对策。

［1］Talekar N，Shelton A.Biology，ecology，and management of the diamondback moth［J］.Annual Review of Entomology，1993，38:275-301.

［2］张友军，吴青君，王少丽，等.我国蔬菜重要害虫研究现状与展望［J］.植物保护，2013，39(5):38-45.

［3］胡珍娣，陈焕瑜，李振宇，等.华南小菜蛾田间种群对氯虫苯甲酰胺已产生严重抗性［J］.广东农业科学，2013，39(1):79-81.

［4］张一宾.新颖杀虫杀螨剂:唑虫酰胺［J］.世界农药，2003(6):43-45.

［5］万年峰，陈晓勤，季香云，等.当归和蓖麻乙醇提取液对甜菜夜蛾生长发育和繁殖的亚致死效应［J］.中国生态农业学报，2013，21(9):1137-1138.

［6］杨洪，王召，金道超.氯虫苯甲酰胺对非靶标害虫褐飞虱实验种群的亚致死效应［J］.应用生态学报，2013，24(2):550-552.

［7］任龙，徐希宝，张靖，等.甲氧虫酰肼对棉铃虫解毒酶活力的亚致死效应研究［J］.农药学学报，2013，15(3):274-277.

［8］刘传秀，韩招久，李凤良，等.应用蛙石萝卜苗法室内继代大量繁殖小菜蛾的研究［J］.昆虫知识，1993，30(6):342-343.

［9］Zhao J，Li Y，Collins H，et al.Monitoring and characterization of diamondback moth(Lepidoptera:Plutellidae)resistance to spinosad［J］.Journal of Economic Entomology，2002，95(2):430-436.

［10］Bradford M.A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye bingding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72:248-254.

［11］李国平，封洪强，梁双双，等.四种杀虫剂亚致死剂量对中黑盲蝽发育和繁殖的影响［J］.昆虫学报，2008，51(12):1260-1264.

［12］陈琼，黄水金，秦文婧.氯虫苯甲酰胺对甜菜夜蛾的亚致死效应研究［J］.江西农业大学学报，2011，33(4):414-416.

［13］王海荣，吴进才，杨帆，等.不同药剂亚致死剂量对褐飞虱不同种群生命表参数的影响［J］.生态学报，2009，29(9):4753-4760.

［14］Yin X，Wu Q，Li X，et al.Sublethal effects of spinosad on Plutella xylostella(Lepidoptera:Plutellidae)［J］.Crop Protection，2008，27:1385-1391.

［15］Wei H，Wang J，Li H，et al.Sublethal effects of fenvalerate on the development，fecundity，and juvenile hormone esterase activity of diamondback moth，Plutella xylostella(L.)［J］.Agricultural Sciences in China，2010，9(11):1612-1622.

［16］Han W，Ren C，Yan H，et al.Sublethal effects of metaflumizone on abamectin-resistant and-susceptible strains of the diamondback moth，Plutella xylostella(Lepidoptera:Plutellidae)［J］.昆虫学报，2012，55(6):694-702.

［17］宋亮，章金明，吕要斌.茚虫威和高效氯氰菊酯对小菜蛾的亚致死效应［J］.昆虫学报，2013，56(5):525-527.

［18］Guo L，Desneux N，Sonoda S，et al.Sublethal and transgenerational effects of chlorantraniliprole on biological traits of the diamondback moth，Plutella xylostella L.［J］.Crop Protection，2013，48:29-34.

［19］Kamleshk.Sublethal effects of insecticides on the diamondback moth Plutella xylostella(L.)［J］.Pesticide Science，1984，15(4):344-352.

［20］Mahmoudvand M，Abbasipour H，Garjan A S，et al.Sublethal effects of hexaflumuron on development and reproduction of the diamondback moth，Plutella xylostella(Lepidoptera:Yponomeutidae)［J］.Insect Science，2011，18(6):689-696.

［21］Nemotoh.Mechanism of resurgence of the diamondback moth，Plutella xylostella(L.)［J］.Japan Agricultural Research Quarterly，1993，27(1):27-32.

［22］Sotan，Motoyaman，Fujisaki K，et al.Possible amplification of insecticide hormoligosis from resistance in the diamondback，Plutella xylostella［J］.Applied Entomology and Zoology，1998，33:435-440.

［23］Fujiwaray，Takahashit，Yoshiokat，et al.Changes in egg size of the diamondback moth Plutella xylostella treated with fenvalerate at sublethal doses and viability of the eggs［J］.Applied Entomology and Zoology，2002，37:103-109.

［24］Chatonp F，Ravanel P，Meyran J C，et al.The toxicological effects and bioacumulation of fipronil in larvae of the mosquito Aedes aegypti in aqueous medium［J］.Pest Biochemistry and Physiology，2001，69(3):183-188.

［25］李晓涛，黄青春，唐振华，等.氟虫腈对二化螟生长发育的影响及对解毒酶的诱导效应［J］.农药学学报，2006，8(3):250-254.

［26］任学祥，王刚，左一鸣，等.噻虫胺对桃蚜的毒力及其亚致死剂量对桃蚜解毒酶系活力的影响［J］.昆虫学报，2011，54(3):299-305.

［27］王建军，田大军.甲氧虫酰肼对斜纹夜蛾亚致死效应研究［J］.棉花学报，2009，21(3):212-217.

［28］梁沛，夏冰，石泰，等.阿维菌素和高效氯氰菊酯亚致死剂量对小菜蛾谷胱甘肽-s-转移酶的影响［J］.中国农业大学学报，2003，8(3):65-68.

［29］夏冰，石泰，梁沛，等.杀虫剂亚致死剂量对小菜蛾羧酸酯酶的影响［J］.农药学学报，2002，4(1):23-27.

［30］尹显慧，吴青君，李学锋，等.多杀菌素亚致死浓度对小菜蛾解毒酶系活力的影响［J］.农药学学报，2008，10(1):28-34.