稻草与苜蓿组合对山羊瘤胃内蛋白微循环效率及增重的影响

张吉鹍，张震宇，吴文旋，李龙瑞，邹庆华

(1.江西省农业科学院 畜牧兽医研究所，江西 南昌 330200;2.内蒙古农业大学 动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018;3.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025;4.江西新天地药业有限公司兽药研究院，江西 峡江 331400)

进入反刍动物小肠中的氨基酸主要由瘤胃微生物蛋白质(30～100%)、瘤胃非降解饲料蛋白质(0～70%)和内源蛋白质(0～10%)组成。其中微生物蛋白质是进入小肠氨基酸的主要来源［1］。研究表明在可降解氮源和可发酵有机物比例适当、数量充足的情况下，瘤胃微生物能合成足以维持正常牛生长和生产(如一定产奶量)的蛋白质，且十二指肠食糜的氨基酸组成往往与微生物蛋白的氨基酸组成相似［2］。由此可见微生物蛋白对十二指肠食糜氨基酸的重要性。因此，研究如何充分利用反刍动物蛋白质营养特点，使达到十二指肠的微生物蛋白质最多，对有效调控反刍动物蛋白质营养、节约蛋白质饲料有重要意义。由于瘤胃原虫对细菌的吞噬，使得瘤胃微生物蛋白对十二指肠的贡献率下降［3-5］。长期以来，对瘤胃原虫在瘤胃内蛋白无效循环的研究中，更多关注于原虫的存留与否对供给小肠微生物蛋白的多寡以及对宿主生产性能的影响［6-10］，而反刍动物低质基础日粮补饲优质牧草对瘤胃原虫吞噬细菌作用的组合效应则鲜见报道。山羊稻草基础日粮补饲适量的苜蓿，由于饲料间的组合效应，改善了瘤胃动力学参数，提高了稻草在瘤胃的发酵率、消化道各部位营养物质流通量与消化率以及微生物蛋白的合成效率、增加了十二指肠氨基酸流量与山羊氮的沉积率［11-15］，但稻草补饲苜蓿对山羊瘤胃内蛋白微循环的影响却知之甚微，而该点正是能够明确查明瘤胃微生物蛋白内循环损失的关键。本研究就是要在前述研究基础上，探讨瘤胃原虫对细菌的吞噬率和细菌氮的吞噬量，从瘤胃蛋白微循环进一步探讨山羊稻草基础日粮补饲适量苜蓿提高微生物氮利用效率的组合效应机制，同时通过增重试验对这种组合效应进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购于Sigma 公司。

1.1.2 试验动物 选9 只体况良好，体质量相近(41.3±1.2)kg，安装永久性瘤胃瘘管的成都麻羊半同胞羯羊进行试验。

1.1.3 试验用混合粗饲料组成 根据前期体外批次发酵的组合效应研究结果［15］，决定在山羊稻草基础日粮中分别补饲25%、50%与75%的苜蓿，也就是将稻草与苜蓿干草(MSL)分别以体积比为75∶25(MSL25)、50∶50(MSL50)与25∶75(MSL75)的比例组成3 个混合粗饲料，并制成草块，MSL25、MSL50 与MSL75 的混合粗饲料干物质中营养成分分析结果见表1，有关试验用饲料营养价值的详细评定结果见“江西几种奶牛常用饲料的多体系营养价值评定”［16］。

表1 试验用混合粗饲料干物质中营养成分Tab.1 Nutrients of experimental mixed forages

1.1.4 试验设计 本试验采用单因子3 处理重复试验设计，按体重相似和随机方法将试验羊只分成3组，每组3 只，分别饲以3 组混合粗饲料，以探讨山羊稻草基础日粮补饲不同水平苜蓿(25%、50%与75%)对山羊瘤胃内蛋白微循环(瘤胃原虫对细菌的吞噬量)及增重的组合效应。

1.1.5 饲养管理 试验羊单笼饲养，预试期14 d，正试期45 d，每日于06:00 和18:00 两次饲喂，自由饮水，常规光照、驱虫与管理。

1.2 测定指标与试验方法

1.2.1 测定指标 ①瘤胃内蛋白微循环主要测定瘤胃原虫对细菌的吞噬量，采用王欢莉等［17］的荧光光度法进行，并计算出瘤胃原虫对细菌的吞噬速率。②增重性能主要测定初始体质量、结束体质量与干物质采食量(DMI)，并计算出总增重、日增重、DMI/日增重以及单位增重的饲料成本(饲料成本/日增重)。

1.2.2 瘤胃细菌与原虫的分离 瘤胃液的采集方法详见“稻草补饲不同水平苜蓿对山羊瘤胃发酵的组合效应研究”［11］，将采集到的瘤胃液参考Wang［18］的方法对瘤胃细菌与原虫进行分离:①采集瘤胃液，4 层纱布过滤，取一部分样品离心(29 000×g，20 min)，收集上清液，制备无菌瘤胃液，4 ℃保存。②其它样品用于分离细菌与原虫，离心(150×g，10 min)后，收集原虫沉淀，并用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS，pH 7.5)洗涤2 次，以无菌瘤胃液悬浸成2 倍浓度的原虫液。③取以上低速离心的上清液，经2 μm 滤膜过滤后，离心(22 000×g，15 min)，沉淀以PBS(pH 7.0)洗涤2 次，离心后以PBS(pH 7.0)悬浸。

1.2.3 DAPI 荧光标记瘤胃细菌 将DAPI 加入细菌悬液染色，37 ℃水浴20 min，离心(22 000×g，15 min)，沉淀用甲醇洗涤1 次，PBS(pH7.0)洗涤2 次，以无菌瘤胃液悬浸成2 倍浓度的荧光标记细菌(fluorescence labeled bacteria，FLB)。

1.2.4 吞噬试验 将标记细菌液加入等体积的原虫悬液中，参考王欢莉等［17］的研究结果，将厌氧培养(39 ℃，50 r/min 摇床)时间分别选定在45 min、60 min 和75 min，并在这些时间点采集样品，所得样品加入等体积甲醛固定液，固定30 min，150×g 离心10 min，分离原虫，上清液用于游离标记细菌的荧光强度测定。

1.2.5 荧光强度测定 采用荧光分光光度计(RF-5301PC，日本岛津)，选择波长Ex=358 nm，Em=461 nm，发射图谱扫描范围340～600 nm，激发光狭缝宽度5 nm，发射光狭缝宽度5 nm，测定样品的荧光强度。

1.3 原虫对细菌吞噬量的计算

式中:A 为原虫对细菌的吞噬量(cells/cell);B 为培养液中初始标记细菌荧光强度(Au);C 为不同时间点所测游离标记细菌荧光强度(Au);Ci为标记细菌初始浓度(cells/mL);K 为常数(340.33 Au);D为原虫浓度(cells/mL)。

1.4 统计分析

采用Microcal(TM)Origin 6.0 软件对所测荧光强度值进行整理，试验数据采用Excel 软件整理，用SAS(6.12)软件的一般线性模型(GLM)程序进行方差(ANOVA)分析和邓肯氏多重比较。

2 结果与分析

2.1 瘤胃原虫对细菌的吞噬量

瘤胃原虫体外不同吞噬时间对细菌的吞噬量结果见表2。由表2 可知，瘤胃原虫在不同吞噬时间对细菌的吞噬量均随着稻草补饲苜蓿水平的增加而增加，但当补饲量达到稻草基础日粮的50%时，原虫对细菌的吞噬量趋于平稳，增加或降低均不明显，MSL50 与MSL75 的结果相似(P＞0.05)。表明山羊稻草基础日粮补饲50%的苜蓿可最大降低瘤胃原虫的吞噬量。就吞噬时间而言，原虫对标记细菌的吞噬量先上升后下降，以60 min 为拐点。这种态势表明，60 min 以前原虫对细菌的吞噬行为占优势，60 min后主要表现为原虫对已吞噬细菌的消化。

2.2 瘤胃原虫对细菌的吞噬速率

经计算的瘤胃原虫体外不同吞噬时间对细菌的吞噬速率结果见表3。由表3 可知，山羊稻草基础日粮补饲苜蓿各时间点瘤胃原虫吞噬细菌的速率，同吞噬量的变化规律一样，随苜蓿补饲水平的增加而减少，到苜蓿补饲量占稻草基础日粮的50%时，趋于平稳，MSL50 与MSL75 的吞噬速率相似(P＞0.05)。就吞噬时间而言，原虫的吞噬速率在45～60 min 时间段内吞噬速率逐渐上升，60 min 时达到高峰，以后逐渐下降。MSL25、MSL50 与MSL75 在60 min 的最大吞噬速率分别为381.91 cells/cell·h、377.02 cells/cell·h 与376.47 cells/cell·h，除MSL50 与MSL75 的组间差异不显著外，其余组间差异显著(P＜0.05)。

表2 山羊稻草基础日粮补饲不同水平苜蓿瘤胃原虫对细菌吞噬量的组合效应Tab.2 The associative effects of rumen protoza on grazing quantity of bacteria for goats fed with RS basic diet supplemented with 3 different level of MSL(cells/cell)

表3 山羊稻草基础日粮补饲不同水平苜蓿瘤胃原虫对细菌吞噬速率的组合效应Tab.3 The associative effects of rumen protoza on grazing rate of bacteria for goats fed with RS basic diet supplemented with 3 different level of MSL(cells/cell·h)

2.3 山羊稻草基础日粮补饲不同水平苜蓿对增重的组合效应

山羊稻草基础日粮补饲不同水平苜蓿对增重的组合效应见表4。由表4 可以看出，尽管试验结束时3 组混合粗饲料的体质量差异不显著(P＞0.05)，但其总增重、日增重均随苜蓿补饲水平的增加而显著增加(P＜0.05)，单位增重所需的饲料也就是山羊干物质采食量(DMI)与日增重之比则随苜蓿补饲水平的增加而降低，MSL50 与MSL75 的组间差异不显著(P＞0.05)，其余组间差异显著增加(P＜0.05)，表明随着苜蓿补饲水平的增加，日粮饲料转化率获得提高，当补饲水平超过50%时，日粮饲料转化率提高不明显。每公斤增重所需的饲料成本以MSL75 的最高，为59.01 元/kg，其次为MSL25(58.49元/kg)，二者差异不显著(P＞0.05)，MSL50 的最低，为48.56 元/kg。MSL75 的每公斤增重所需的饲料成本高，主要是由于苜蓿占的比例较高所致(苜蓿按3.5 元/kg，稻草按0.6 元/kg 计，则每公斤MSL75、MSL50 与MSL25 混合粗饲料的价格分别为2.78 元、2.05 元与1.33 元)，而MSL25 的每公斤增重所需的饲料成本较高，主要是因为MSL25 的日增重较低所致(MSL25 的日增重为861.45g，仅为MSL75 组2 216.85 g 的38.86%)，二者具有本质区别。这也从另一方面证明，在(羊肉价格不好)市场不景气的条件下，养殖户常以低质粗饲料饲喂山羊，仅补给少量优质粗饲料甚至不补饲，不仅不能节约饲料成本，而且增加饲料成本。相反，应该充分利用当地饲料资源，充分利用饲料间的组合效应，来提高低质粗饲料的利用效率，降低饲料成本，确保好的养殖效益。

表4 山羊稻草基础日粮补饲不同水平苜蓿对增重的影响Tab.4 The associative effects on weight gain of goats fed with RS basic diet supplemented with 3 different level of MSL

3 讨论与结论

3.1 山羊稻草基础日粮补饲适量苜蓿提高了瘤胃内蛋白微循环效率

饲喂低质饲料的反刍动物，全部或部分驱除原虫，可增加细菌与真菌的数量，进而增加纤维的降解率［7，19-21］。因此，有理由认为，山羊稻草基础日粮补饲苜蓿，降低了原虫对细菌的吞噬量与吞噬速率，因而亦能增加基础日粮的消化率，这在“山羊稻草基础日粮补饲不同水平苜蓿对消化道各部位营养物质消化率的影响研究”中得到了验证。反刍动物瘤胃原虫不能利用氨氮合成自身的蛋白质，只能利用微生物及饲料中的蛋白质作为其主要氮源。虽然原虫也能部分降解蛋白质，但其降解的速度特别慢，而细菌还是降解蛋白质的主要瘤胃微生物。由于原虫对细菌的吞噬作用，会导致微生物氮的产量降低，增加宿主动物对蛋白质的维持需要，同时由于原虫在瘤胃内的滞留时间长，以及反刍过程与空气中的氧接触的机会较多，大部分原虫由于自溶而死亡，所以原虫氮很少能进入真胃和十二指肠为宿主所利用。试验证明，全部［19-20］或部分［7，21］驱除原虫可降低饲料和细菌蛋白的降解率，提高微生物氮的产量，增加过瘤胃蛋白的数量。可以认为，山羊稻草基础日粮补饲适量苜蓿，由于减少了瘤胃原虫对细菌的吞噬量，从而提高了瘤胃内蛋白微循环效率，进而提高十二指肠氨基酸流量［14］与氮沉积［12］。本研究瘤胃原虫在不同时间点对细菌的吞噬量与吞噬速率的变化规律及结果与王欢莉等［17］报道的徐淮山羊的结果相似。

3.2 山羊稻草基础日粮补饲适量苜蓿提高了增重的经济效益

本研究MSL25、MSL50 与MSL75 的日增重分别为19.14 g/d、40.40 g/d 与49.26 g/d，并未以等比例(以25%的水平)随苜蓿补饲水平的增加而增加，表明其中存在着组合效应，正是苜蓿的补饲提高了低质秸秆粗饲料稻草的利用率。MSL75 的日增重与王旭［22］、张吉鹍［23］先前报道的相似，MSL50 的略低，而MSL25 则仅为2/5。MSL25、MSL50 与MSL75 的单位增重所需的饲料(或曰饲料报酬)分别为44.14、23.69 与21.26，较王旭、张吉鹍先前报道的要高，特别是MSL25 要高出2 倍多，主要是因为王旭、张吉鹍先前报道的是经GI(粗饲料分级指数)优化的混合粗饲料。这从反面验证了粗饲料优化的重要性及日粮中不重视饲料间的组合效应给养殖利润造成的损失。尽管苜蓿补饲超过50%后，单位增重所需的饲料趋于平稳，MSL50 与MSL75 的差异不显著(P＞0.05)，但单位增重所需的饲料成本MSL75 较MSL50 却显著增加(P＜0.05)，甚至还高于日增重最低的MSL75，表明山羊稻草基础饲料补饲优质饲料并不是越多越好，而是要充分利用当地粗饲料资源，利用饲料间的组合效应提高低质粗饲料的利用率，以降低饲料成本，提高养殖效益。

本研究结果表明，山羊稻草基础日粮补饲50%的苜蓿可提高瘤胃内蛋白微循环效率，获得好的增重性能。

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