米糠肽抗氧化活性研究

刘梁，孙维矿，赵玲，李赫宇，陈新，*

（1.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023；2.天津市益倍建生物技术有限公司，天津300457）

近些年，功能活性肽因其健康安全等特点已成为食品领域研究最为热门的课题之一，而从植物蛋白中提取活性肽更受人们青睐，其中抗氧化肽尤其受到人们的关注[1-2]。相关研究表明证明米糠蛋白水解提取物的抗氧化值为19.9 mg/g，约为VC的27倍，约为大豆肽的1.9倍[3]。由6～30个氨基酸组成，分子量在70 u～3600 u的米糠肽具有强抗氧化性[4]。张强等通过酶解米糠蛋白制备得到的米糠抗氧化肽，对常见的自由基如O2-·和·OH均具有良好的捕获能力[5]。梅德军等选用两种蛋白酶木瓜和风味蛋白酶水解制备米糠制得抗氧化肽[6]。通过酶水解法制得的米糠抗氧化肽的水解度为23.67%，对DPPH自由基清除率可达64.26%[7]。从目前的研究看来，从米糠中提取单一抗氧化物质，利用率不高[8]。不同天然抗氧化成分之间存在着协同效应，复合组方抗氧化功能比单一组分更好[9]。目前，将米糠肽作为抗氧化成分的单方或复方商业化产品基本上没有，但是鉴于大豆蛋白和活性肽产品的成功开发，米糠活性肽及其复合物又具有抗氧化的生理活性使得其将会是食品行业的研究热点[10-11]。基于米糠总提取物及米糠肽水解前后抗氧化活性的变化，测定了不同浓度米糠总提取物及米糠蛋白抗氧化提取物清除羟自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O2-·）能力，研究酶解工艺对米糠多肽抗氧化活性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

米糠提取物有本实验提取所得；EDTA、H2O2、Tris、乙醇、邻苯三酚：国药集团；FeSO4、抗坏血酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、盐酸：科密欧公司；α-脱氧核糖，北京奥博星生物公司；乙酸，天大化学试剂厂。

1.2 仪器和设备

电子天平（AL204-01）：梅特勒-托利多仪器有限公司；电子恒温不锈钢水浴锅（HHS-2S）：上海光地仪器设备有限公司；紫外-可见分光光度计（752N）：上海光谱仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羟自由基（·OH）清除能力的测定方法

采用α-脱氧核糖氧化法测定。10 mmol/L的FeSO4-EDTA混和液取0.2 mL于具塞试管中，加入0.20 mL的α-脱氧核糖溶液（10 mmol/L），然后加入0.20 mL 的 2、4、6、8、10 mg/mL 的样品（米糠总提取物或纯化米糠肽）溶液，并用pH=7.4磷酸盐缓冲液定容到1.8 mL，最后加入0.20 mL的10 mmol/L的双氧水，混匀后于37℃水浴中保温1 h，然后加入1 mL质量分数2.8%的三氯乙酸（TCA）溶液，加入质量分数1.0%硫代巴比妥酸（TBA）溶液1.00 mL，混匀后沸水浴加热10 min；冷却后，在532 nm波长下用紫外分光光度计检测，以蒸馏水为参比，测得其吸光度为A1。同上操作处理，不加异黄酮溶液，测定其对比吸光度A2。其他处理同上，不加异黄酮溶液且不在37℃水浴中反应，测定空白吸光度A3。样品的自由基清除能力（scavenging activity，SA）可表示为：SA（%）=[1-（A1-A3）/（A2-A3）]×100。

1.3.2 超氧阴离子自由基（O2-·）清除能力的测定方法

在pH8.2，2.8 mL 50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液中加入0.1 mL蒸馏水，于25℃保温10 min，加入25℃预温的60 mmol/L的邻苯三酚0.1 mL，总体积为3.0 mL，迅速混匀，转移至比色杯中，在420 nm处，每隔30秒测一次吸光度，作为对比。测得吸光度记做A1。同上，在缓冲体系中加入0.1 mL米糠总提取物或纯化米糠肽溶液，测得吸光度记做A2。其它条件相同，在同样的缓冲体系中加入25℃预温的10mmol/L的盐酸0.1mL，测得吸光度记做A3。通过公式“清除率/%=A1-（A2-A3）/A1×100”计算超氧阴离子自由基清除率。

2 结果与讨论

2.1 米糠酶解前后羟自由基（·OH）清除能力测定

利用芬顿（Fenton）反应体系产生·OH，通过考察和分析·OH对2-脱氧核糖分子的氧化及破坏情况，确定米糠肽、米糠提取物以及二者水解产物的存在是否对·OH具有清除能力，保护2-脱氧核糖分子不被氧化破坏。分别利用 2、4、6、8、10 mg/mL 的样品溶液，测定相应的羟自由基清除率，实验结果如图1～图2所示。

图1 米糠肽水解前后羟自由基清除作用Fig.1 The scavenging capacity to hydroxyl free radical by rice bran peptide before and after hydrolysis

图2 米糠水解前后提取物羟自由基清除作用Fig.2 The scavenging capacity to hydroxyl free radical by the total extract of rice bran before and after hydrolysis

在邻苯三酚在自氧化反应中，随着米糠提取物浓度的增大对邻苯三酚自氧化抑制就越强，在420 nm处形成的有光吸收的中间产物越少，样品吸光度A2相应数值也越低，从而清除率逐渐增大。实验结果如图1、2所示，米糠总提取物和米糠肽都具有一定的羟基自由基清除能力，且米糠总提取物的清除能力强于纯化米糠肽；米糠总提取物和米糠肽在经过水解后对羟基自由基的清除能力均显著增强；随着受试样品浓度的增大，受试样品对羟自由基的清除能力逐渐增强。

2.2 米糠酶解前后超氧阴离子自由基清除能力测定

分别利用 2、4、6、8、10 mg/mL 的样品溶液，测定相应的超氧自由基清除率，如图3～图4所示。

图3 米糠肽水解前后超氧阴离子自由基清除能力比较Fig.3 The scavenging capacity to superoxide radical by rice bran peptide before and after hydrolysis

图4 米糠酶解前后醇提物超氧阴离子自由基清除能力比较Fig.4 The scavenging capacity to superoxide radical by the total extract of rice bran before and after hydrolysis

实验结果如图3、4所示，超氧自由基清除率随样品浓度增大而增大。米糠酶解醇提物和米糠肽对超氧阴离子自由基的清除能力明显大于酶解前超氧阴离子自由基清除能力。

3 结论

对米糠总提取物、纯化米糠肽以及二者水解产物的抗氧化活性进行了比较研究，实验结果证实，米糠总提取物、纯化米糠肽以及二者水解产物均有对·OH和O2-·的清除能力，二者对·OH和O2-·的清除能力随浓度增加而增强。进一步对比分析可得出以下结论，米糠总提取物的抗氧化活性强于纯化米糠肽，二者的水解产物的抗氧化活性强于水解前。

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