正交实验法优选黄连中盐酸小檗碱醇提工艺的研究

陈程

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

黄连为毛莨科植物黄连的干燥根茎［1］。盐酸小檗碱为黄连中含量最高的原小檗碱型生物碱，也是最重要的活性成分之一，具有抗炎、抗菌、抗癌，治疗糖尿病和心血管疾病，及抑制脂肪分化等多方面药理作用［2-3］。盐酸小檗碱是一种季铵生物碱，其盐类在水中溶解度低，水提不能达到很好的提取效果［4］。故本研究选用乙醇回流提取。

以盐酸小檗碱含量和干膏得率作为评价指标，采用正交实验法优选最佳醇提工艺。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

黄连饮片，经西安医学院生药教研室鉴定为毛茛科植物黄连的干燥根茎;盐酸小檗碱(批号110733-200806);乙腈、甲醇均为色谱纯;水为双蒸馏水;乙醇、盐酸均为分析纯。

Waters 2695 高效液相色谱仪，Waters 2695 泵，Waters 2996 二极管阵列检测器，Empower2 色谱工作站;Fw-200 高速万能粉碎机;RE-52-05 旋转蒸发仪;梅特勒GB204 电子天平(万分之一)。

1.2 实验方法

称取黄连药材9 份，每份10 g，分别按L9(34)正交表安排的方案进行提取，提取液备用。测定并计算盐酸小檗碱含量和干膏得率。正交实验因素水平见表1。

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

1.3 盐酸小檗碱HPLC 法检测

1.3.1 色谱条件 色谱柱为Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钾 溶 液(50 ∶50，pH 调 为4. 0)，检 测 波 长345 nm，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃。

1.3.2 对照品溶液制备 精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含10 μg 的溶液。

1.3.3 供试品溶液制备 分别精密移取0.1 mL 提取液，置于蒸发皿中，水浴蒸干。用甲醇溶解至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，过滤，取续滤液，即得。

1.3.4 标准曲线绘制 精密吸取对照品溶液2，5，10，15，20 μL 进样，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标作图，线性回归，得标准曲线方程，y=156 548x+27 954，R2=0.999 6。表明盐酸小檗碱在进样量0.02 ～0.2 μg 内，线性关系良好。

1.3.5 样品含量测定 分别注入对照品溶液和供试品溶液各10 μL 于液相色谱仪中，计算盐酸小檗碱含量。

1.4 干膏得率的测定

精密量取提取液5 mL，置蒸发皿中水浴蒸干，减压干燥，精密称定质量，计算干膏得率。

2 结果与讨论

2.1 正交实验结果

正交实验结果见表2，方差分析见表3。

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal test

由表2 可知，各因素的影响次序依次为C ＞D ＞B ＞A，即溶剂用量＞提取次数＞提取时间＞乙醇浓度。方差分析结果表明，C(溶剂用量)因素有显著性影响(P ＜0.05)。从实际工业生产考虑，选定最佳工艺条件为A1B1C3D3，即50%乙醇提取3 次，每次提取时间1.5 h，3 次加醇量分别为8，6，6 倍。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.2 验证实验

按照正交实验优选出的最佳工艺条件重复3次，以验证该提取工艺条件是否具有重现性，结果见表4。结果表明该提取工艺稳定、可行。

表4 验证实验结果(n=3)Table 4 Verification experiment results(n=3)

2.3 分析方法的方法学考察

2.3.1 精密度 精密吸取对照品溶液10 μL 进样，重复进样5 次，测定盐酸小檗碱峰面积积分值。结果RSD 值为1.01%。

2.3.2 稳定性 精密吸取供试品溶液，于12 h 内测定，结果盐酸小檗碱峰面积RSD 值为0.55%，供试品溶液在0 ～12 h 内基本稳定。

2.3.3 重复性 取同一批的黄连药材5 份，制备5份供试品溶液，测定并计算盐酸小檗碱峰面积的RSD 值为1.37%，重复性良好。

2.3.4 加样回收率 精密移取6 份已知含量的样品0. 05 mL，置蒸发皿中，分别精密加入相当0.05 mL 样品溶液80%，100%，120%的盐酸小檗碱对照品溶液，按照供试品溶液制备方法和色谱条件测定，测得平均回收率为99.73%，RSD 为1.01%。结果表明，本方法回收率良好。

3 结论

(1)黄连中盐酸小檗碱的醇提最佳工艺条件为:50%乙醇提取3 次，每次提取时间1.5 h，3 次加醇量分别8，6，6 倍。该醇提工艺重现性和稳定性良好。

(2)用HPLC 法测定黄连中盐酸小檗碱含量，该方法分离较好，稳定可行。

［1］ 郑汉臣.药用植物与生药学［M］.北京:人民卫生出版社，2006.

［2］ 崔学军.小檗碱的药理学研究进展及临床新用途［J］.时珍国医国药，2006，17(7):1311-1312.

［3］ Niu Lingying，Qiao Wei，Hu Zhendong，et al.Berberine attenuates lipopolysaccharide induced impairments of intestinal glutamine transport and glutaminase activity in rat［J］.Fitoterapia，2011，82(3):323-330.

［4］ 徐媛.正交试验法优选黄连中小檗碱提取工艺［J］.中国中医药信息杂志，2011，18(5):60-61.