用HPLC 测定羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯含量的研究

李宗霖，麻纪斌，曲秦，翟帆，舒泉湧，秦湫红

(陕西新药技术开发中心，陕西 西安 710075)

对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯是合成4-(4-胍基苯酰氧基)苯乙酸-N，N-二甲基氨基甲酰甲酯甲磺酸盐(甲磺酸卡莫司他)的中间体，甲磺酸卡莫司他是日本小野药品工业研究所开发的非肽类蛋白酶抑制剂，临床用于慢性胰腺炎的治疗，对胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、凝血酶等有很强的抑制作用［1-2］。

对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯作为甲磺酸卡莫司他的重要中间体，它的控制方法对甲磺酸卡莫司他的合成具有很大影响［3-4］。由于合成工艺过程中可能引入副产物［5］，而且作为中间控制，快速、简便、准确的测定方法对于中间体的质量控制具有不可替代的作用。本文建立了HPLC 检测对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯的方法，为其工业生产质量控制提供了有效依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯对照品，自制，含量98.5%;对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯，自制;纯净水;乙腈，色谱纯。

Ag135 电子天平;Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪;KQ-300VDE 型双频数控超声波清洗器;VARIAN cary 50 紫外可见分光光度计。

1.2 溶液配制

1.2.1 对照品溶液的制备精密称取对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯对照品10. 0 mg，置50 mL容量瓶中，加入乙腈/水(流动相)适量，超声5 min 使溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀。精密吸取1 mL 至10 mL 容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。

1.2.2 供试品溶液的制备精密称取对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯样品10.0 mg，置50 mL容量瓶中，加流动相适量，超声5 min 使溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀。精密吸取1 mL 至10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 检测波长的选择以乙腈水为溶剂，配制对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯的溶液，在190～400 nm 波长下连续扫描，发现其最大吸收波长为275 nm。因此，确定检测波长为275 nm。

2.1.2 流动相配比的选择在HPLC 检测中，乙腈具有较低的吸光度，洗脱能力也较强，因此采用乙腈-水为流动相。为确保对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯与杂质的完全分离，以不同配比的乙腈与水进行实验，最后确定流动相配比为:乙腈∶水=30∶70(V/V)。

2.1.3 色谱条件色谱柱为Thermo Syncronis C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(30∶70，V/V)，检测波长为275 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 μL。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系精密称取对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯对照品10.0 mg，置100 mL 容量瓶中，加流动相适量，超声5 min 使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，即为对照品储备液。从对照品储备液中精密量取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，用流动相稀释定容至10 mL 容量瓶中，得一系列不同质量浓度的对照品溶液。分别精密量取20 μL 进样测定。以进样量(μg)为横坐标，对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯峰面积(mAU ×min)为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归，得方程:y = 0.971 0 x－0.002 3，R2= 0.999 9。对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯在0.2 ～1.0 μg 范围内线性关系良好。2.2.2 精密度实验精密量取对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯对照品溶液，按上述色谱条件，分别重复测定5 次，结果见表1。

表1 精密度考察结果Table 1 Results of precision experiment

由表1 可知，对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯峰面积的RSD 为1.69%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重现性实验精密称取同一批样品5 份，按供试品溶液制备方法平行处理并测定，结果见表2。

表2 重现性考察结果Table 2 Results of repeatability experiment

由表2 可知，对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯峰面积的RSD 为2.23%，表明本方法重复性良好。

2.2.4 稳定性实验精密称取同一批样品，制成供试液，分别于0，2，4，8，12 h 测定峰面积，结果见表3。

表3 稳定性考察结果Table 3 Results of stability experiment

由表3 可知，对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯峰面积的RSD 为2.27%，说明供试液在12 h内稳定性良好。

2.2. 5 加样回收率实验精密称取已知含量(97.5%)的同一批对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯样品9 份，每份约0.10 g，分别精密加入一定量的对照品，制备成供试品溶液后，精密量取5.0 mL，置于100 mL 容量瓶中，按色谱条件测定，结果见表4。

表4 回收率实验结果(n=9)Table 4 Results of recovery experiment (n=9)

2.3 样品测定

取对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯及3批次样品，按外标法以峰面积计算含量，结果见图1、图2。

图1 对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯对照品色谱图 Fig.1 The chromatogram of reference of N，N- dimethylcarbamoylmethyl-p-hydroxyphenylacetate

图2 对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯样品色谱图Fig.2 The chromatogram of sample of N，Ndimethylcarbamoylmethyl-p-hydroxyphenylacetate

3 结论

采用HPLC 法分析对羟基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯含量，线性关系良好，主要成分和杂质分离完全，分析时间短，精密度和重现性高，具有快速、简便、准确等特点，适用于工业生产过程中的质量控制和产品的质量分析。

［1］ Hashimoto K.Camostat mesilate［J］.Drugs of the Future，1985，10(11):897-899.

［2］ Asami T，Tomisawa Y，Uchiyama M. Effect of oral camostat mesilate on hematuria and/or proteinuria in children［J］.Pediatr Nephrol，2004，19(3):313-316.

［3］ Setsuro F，Yoshiaki U，Tsuyoshi W，et al.Guanidinobenzoic acid derivatives:US，4021472［P］.1977-05-03.

［4］ Sugano Hideki.New production method of camostat mesylate:JP，9309873［P］.1997-12-02.

［5］ 王晓天，张建宾，金汝城.对胍基苯甲酸盐酸盐的制备及衍生物卡莫他特甲磺酸盐的合成［J］. 精细化工，2004，21(8):597-599.