苏钟猪个体身份SNP 识别的数字条形码编制

胡肄农， 丁 潜， 纪红军， 王晓晓， 朱振坤，4， 赵庆顺， 邢光东

(1.江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014;2.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京210014;3.南京大学模式动物研究所，江苏 南京210061;4.南通大学公共卫生学院，江苏 南通226001)

中国是猪肉生产和消费大国，猪肉是中国居民消费的最主要的肉类产品。但近年来食品安全问题频发，严重影响了消费者的健康，所以建立可靠的猪肉产品溯源系统，实现猪场到餐桌全程双向可追踪溯源，对遏制养猪生产中瘦肉精、重金属等的滥用，控制兽药的残留，传染性疾病的传播，促进养猪业的健康发展等起十分重要的作用。

猪肉产品的溯源技术和方法很多［1-2］，目前大都采用耳标等标签溯源，这一技术具有操作简单和成本低的特点，但因其标签易损、易脱落丢失、易混淆，且易在猪活体、胴体和猪肉产品间分离而难以保障猪肉产品溯源的准确性。基因组DNA 存在于动物每个细胞，不因动物产品加工等发生改变，具有准确、可靠等特点而被看好用于猪肉产品溯源［3］。目前研究热点主要集中在微卫星或单核苷酸标记的多态性(SNPs)如何用于猪肉产品的溯源［4-6］。SNP 是指同一物种不同成员间或同一个体的成对染色体在同一基因组DNA 位点上出现的单个核苷酸之间的变异，是可遗传的变异中最常见的一种，具有分布广、密度高的特点，SNP 常被开发为DNA 指纹。本研究通过挖掘苏钟猪基因组DNA 的SNP 位点，研究编制苏钟猪个体身份识别的DNA 条形码并形成相应的数字条形码，为猪种个体身份识别及肉产品溯源方法的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用猪为江苏省农业科学院选育的江苏省级品种苏钟猪。选取7 头公猪和12 头母猪所生的96头苏钟猪，并拔取猪毛(含毛囊)，剪短至1.5 cm，用DNA MiniExtract 试剂盒(南京润邦生物技术有限公司生产)制备DNA 模板。单个样本DNA 模板制备过程为:将数根猪毛毛囊端朝下插入装有17.6 μl DNA MiniExtract 的PCR 管中，PCR 仪中95 ℃ 5 min，16 ℃1 min 后，加入浓度为20 mg/ml蛋白酶K2.4 μl，55 ℃2 h，95 ℃10 min，16 ℃1 min，离心取上清液作PCR 扩增模板。混合样本DNA 模板制备过程为:每头猪选取1 根猪毛，毛囊端朝下混合插入装有352 μl DNA MiniExtract 的离心管中，95 ℃水浴5min 后，冷却至常温，加浓度为20 mg/ml蛋白酶K48 μl，55 ℃水浴2 h，冷却至常温后离心取上清液作PCR 扩增模板。

1.2 引物设计与PCR 扩增

初期根据GenBank 登录的猪基因序列设计29对引物，并用混合样本DNA 模板扩增，扩增产物直接测序并选择测序图谱背景干净，序列阅读无歧义且扩增产物存在SNP 位点的7 对引物用于苏钟猪个体身份DNA 识别的数字条形码编制。7 对引物扩增基因的GenBank 序列登录号分别为AF327369、AF034974、AF473820、X68247、AJ251197、AF038553和M29939。

7 对引物PCR 反应体系总体积均为20 μl，其中:Milli-Q 13.1 μl、25 mmol/L Mg2+2.0 μl、10 ×Buffer 2.0 μl、5 mmol/L dNTP 0.8 μl、5 μmol/L正反向游引物各1.0 μl、Taq酶0.1 μl、混合样本或单个样本DNA 模板1.0 μl。反应条件:95 ℃预变性2 min;95 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s 或60 s，共35 个循环;72 ℃延伸10 min。各引物对的退火温度和延伸时间见表1。

1.3 扩增片段SNP 位点筛选、个体身份识别的DNA 条形码及相应的数字条形码编制

7 对引物共扩增52 个SNP 位点，结合后续的单个样本DNA 模板扩增产物中的SNP 位点关联性分析(基因分型完全一致的SNP 位点保留其一)及杂合度(H≥0.1)计算，最终确定41 个SNP 位点用于苏钟猪个体身份识别的DNA 条形码编制。这些SNP 位点以扩增产物中碱基所在的顺序位置标记，其中正向引物的第1 个碱基标记为+1(表2)。数字条形码编制时，41 个SNP 位点先组合形成DNA 条形码;DNA 条形码中SNP 位点排列，以引物对1 ～7 依次排列，其中每对引物的SNP 位点以5'至3'顺序依次排列(表2)。DNA 条形码中10种SNP 位点的基因型AA、TT、GG、CC、AT、AG、AC、TG、TC、GC 分别由数字0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 共10 个阿拉伯数字代替，形成相应的数字条形码。

表1 各引物对及相应的退火温度和延伸时间Table 1 Primers and their annealing temperatures and extending times for PCR reactions

表2 用于猪个体身份识别的7 对引物扩增的SNP 位点Table 2 SNPs used for identification of pig individuals amplified by 7 primer pairs

2 结果与分析

根据41 个SNP 位点编制的数字条形码，很好地区分了96 头苏钟猪的个体身份，且区分度较好(表3)。96 头苏钟猪是7 头公猪、12 头母猪所生后代，其中大多为全同胞。理论上，全同胞遗传背景基本相同或相近，个体身份最难识别，编制的数字条形码差异性应该较小，但结果却与之不相符。例如1-12 号是全同胞猪，它们的数字条形码一一比对结果发现，5、6 号猪差异最小，数字条形码只有2 对引物扩增的4 个SNP 位点存在差异(表3 中用黑体字表示);但7、8 号猪却存在30 个SNP 位点的差异(表3中用黑体字表示)，这或许与父母本41 个SNP 位点的杂合状态有关。

表3 编制的用于个体身份识别的96 头苏钟猪数字条形码Table 3 Digital barcodes used for identification of Suzhong swine individuals

3 结论

DNA 存在于动物的每个细胞之中，且不受食品加工等人为影响，具有准确、可靠等特点，因此利用DNA 进行个体身份识别或肉产品溯源，是一种有效的遗传学方法。SNP 是基因组DNA 变化的最简单形式［7］，在基因组中普遍存在，频率大概是0.1%或以上［8］，筛选相对容易;而且动物个体不同染色体的SNP 位点组合形成的信息丰富，因此SNP 常被开发为DNA 指纹，且可用于动物个体身份识别。以猪(共19 对染色体)为例，假如一对引物仅扩增1 个SNP 位点，那么针对19 条染色体的19 对引物扩增的SNP 位点可组合形成319种基因型，即可用于识别约1.1 ×109头猪的个体身份识别或肉产品溯源。而且针对高突变区的1 对引物可同时扩增出多个SNP 位点，虽然扩增片段连锁，但常常存在多种基因型，这些引物对扩增片段组合形成的信息更为丰富。本研究筛选7 对引物，扩增52 个SNP 位点，经关联性分析及杂合度过滤(H≥0.1)后，选留41 个SNP位点，用于苏钟猪个体身份识别。96 头苏钟猪样本的扩增产物中，分离到的基因型数分别为9、11、7、20、3、10 和12 种。7 对引物扩增片段可组合成9 ×11 ×7 ×20 ×3 ×10 ×12 =4 989 600种基因型，理论上可用于近5.0 ×106头猪个体身份DNA 识别的数字条形码编制，基本可以满足规模苏钟猪养猪场猪的个体身份识别。

同时，虽然不同猪种共有一些SNP 位点，但由于种群的地理隔绝，可能导致SNP 在不同种群中的频率不同，而且一个在某个种群或种族中常见的SNP 等位基因很少出现在另一个种群或种族内。因此，本研究所筛选的苏钟猪高杂合度SNP 位点，可满足苏钟猪的个体身份识别及肉产品溯源所需，其他猪种的个体身份识别，需要通过挖掘品种自有的高杂合度SNP 位点，重新组合或调整SNP 条形码识别技术，提高个体身份识别的准确率。

DNA 个体身份识别具有准确、可靠的特点，可优选用于种猪个体身份识别的条形码编制及档案库建设。目前，DNA 个体身份识别成本较耳标等识别方法相对较高，猪场每头猪编制SNP 个体身份条形码不太现实，但可以在偶发事件需要精准溯源时，作为耳标等识别方法的一种补充。同时，规模猪场可以分批备份出售或待屠宰猪样本，通过编制并比对待识别猪个体或同批次备份猪样本的数字条形码，在大幅降低溯源成本的同时，达到肉产品溯源目的。随着基因测序技术的进步及成本的大幅降低，不久的将来DNA 个体身份识别技术将有广泛的应用市场。

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