辣椒胞质雄性不育相关基因的克隆及表达

王述彬， 刁卫平， 刘金兵， 潘宝贵， 戈 伟， 郭广君

(江苏省农业科学院蔬菜研究所，江苏 南京210014)

细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)是自然界的普遍现象，到目前为止已在300 多种植物中发现细胞质雄性不育现象［1-3］。植物胞质雄性不育在作物杂种优势利用中有着重要的应用价值，长期以来，研究者一直对植物细胞质雄性不育的分子机理进行探索研究。

辣椒(Capsicum annuumL.)作为常异花授粉植物，具有非常明显的杂种优势。自Martin、Grawford和Perterson 最先报道辣椒雄性不育现象以来，国内外围绕辣椒细胞质雄性不育已开展了大量的研究工作，包括不育相关基因分子标记筛选［4-8］、不育相关基因分离［9-11］以及不育性状的相关机制研究［10，12］。目前，已鉴定分离的与辣椒细胞质雄性不育性关系最为紧密的候选基因有orf456和atp6基因，在orf456转基因试验中发现45%的转基因植株具有雄性不育性［10］。然而，辣椒细胞质雄性不育资源的匮乏以及不育性状的复杂性，使得研究者在不育相关基因分离和功能研究中仍存在明显不足。

大量研究结果表明，线粒体基因组与CMS 直接相关，植物细胞质雄性不育是由线粒体基因突变、嵌合、不完全编辑、重组等原因产生新的功能区造成的［13-14］。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)是一种新型的PCR 技术，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程中产物的变化，从而通过标准曲线对DNA、RNA 样品中目标基因的表达进行定性或者定量分析［15］。由于操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强的特点，qRT-PCR 已广泛用于拟南芥、水稻等典型植物的基因表达水平的检测［16］。

为了更好地利用辣椒细胞质雄性不育进行杂种优势育种，进一步阐述辣椒细胞质雄性不育的相关机理，本文以辣椒细胞质雄性不育系21A 及其相应的保持系21B 的mtDNA 为材料，采用SRAP 分子标记技术筛选辣椒胞质雄性不育相关基因，并利用qRT-PCR 对获得的不育相关基因在不同组织中的表达模式进行分析，以期获得与辣椒胞质不育性紧密相关的候选基因，为最终克隆获得辣椒细胞质雄性不育基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用材料为江苏省农业科学院蔬菜研究所辣椒课题组提供，辣椒细胞质雄性不育系21A 及其相应的保持系21B 由法国不育源LEANS 经多代回交转育而成［17］。试验材料种植于江苏省农业科学院蔬菜研究所大棚内，常规田间管理。

1.2 线粒体DNA 提取及SRAP 和SCAR 分析

对辣椒细胞质雄性不育系21A 及保持系21B的黄化苗分别进行混合取样，构建不育池和可育池，线粒体DNA 的提取及纯化主要参考Kemble 等［18］方法，并加以改进。参照Li 等［19］方法进行SRAP 引物设计，引物由上海英俊生物技术有限公司合成。利用SRAP 标记分析不育池和可育池，筛选两池间的差异，获得多态性条带。根据SRAP 特异片断测序结果，使用Primer 5.0 软件设计SCAR 特异引物，并根据测序序列长度大小进行SCAR 标记命名。

1.3 多态性条带的回收、纯化、克隆与测序

参照袁稳等［11］方法进行多态性条带的回收及纯化，利用PCR 纯化试剂盒(购自碧云天)纯化二次PCR 产物。纯化产物连接于pGEM-T Easy(Promega)上，并转化DH5α 感受态细胞，37 ℃培育12 ～14 h 后，挑取单克隆，在含有60 mg/L 氨苄青霉素的LB 液体培养基中培育过夜，PCR 鉴定阳性克隆，并送往南京思普金生物科技有限公司测序。利用NCBI 网站上的Blast 软件对测序结果在GenBank 中进行序列同源性比较分析。

1.4 RNA 提取及qRT-PCR 分析

以辣椒盛花期的7 个不同组织(根、茎、叶、微花蕾、小花蕾、中花蕾、大花蕾)为试验材料进行总RNA 的提取和cDNA 第一链的合成，方法参照植物总RNA 提取试剂盒(购自天根生物技术公司)和反转录试剂盒(购自TaKaRa)操作程序进行。以Actin1为荧光定量PCR 的内参基因，标准曲线构建及数据处理分析参照Wang 等［20］方法进行。

2 结果与分析

2.1 特异片断序列分析

经SRAP 引物组合在辣椒细胞质雄性不育系21A及保持系21B 的线粒体DNA 扩增后，获得了3 条稳定存在的多态性条带M6E15、M7E11和M7E12(图1)。对多态性条带进行回收、纯化、克隆和测序，长度大小分别为721 bp、394 bp 和285 bp，分别命名为CMS721、CMS394和CMS285。在NCBI 上进行Blast 同源性比较分析，发现3 个差异片断都与能量代谢有关(表1)。结果表明，辣椒细胞质雄性不育系21A 不育性产生的原因可能是由于线粒体基因组发生重排，导致线粒体功能紊乱，致 使小孢子发育过程中能量不足。

图1 辣椒细胞质雄性不育系21A 及保持系21B 线粒体DNA 的SRAP 扩增结果Fig.1 SRAP amplification of mitochondrial DNA of CMS line 21A and its maintainer line 21B

表1 SRAP 分离到的辣椒细胞质雄性不育系21A 及保持系21B 线粒体DNA 差异片断的序列分析Table 1 Sequence analyses of different fragments in mtDNA of CMS line 21A and its maintainer line 21B in pepper by SRAP

2.2 SRAP 标记转化为SCAR 标记

根据多态性片断测序结果，利用Prime 5.0 软件进行特异引物设计，分别命名为SCAR721、SCAR394和SCAR285并在辣椒细胞质雄性不育系21A 和保持系21B 单株DNA 中扩增验证。结果显示，设计的3 对特异引物均在不育系21A 单株中得到有效扩增，扩增片断大小与设计预期结果一致，而在保持系中无扩增条带(图2)，表明已成功将SRAP 引物转化为SCAR 引物。

图2 特异SCAR721引物在不育系21A 和保持系21B 单株基因组DNA 中的扩增结果Fig.2 The amplification patter of genomic DNA of CMS line 21A and its maintainer line 21B by specific primer SCAR721

2.3 CMS721、CMS394、CMS285基因的表达分析

为研究花蕾发育时期与辣椒细胞质雄性不育性之间的关系，选取不同发育时期的花蕾(图3)以及根、茎和叶为试验材料提取RNA。提取的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，电泳条带清晰，无DNA 污染，经分光光度计测定OD260/280为1.9 ～2.2，OD260/230为2.1 ～2.2，表明所提取的RNA纯度较好，能满足试验需要。

图3 不同大小的花蕾Fig.3 Buds with different size

以不育系21A 及相应保持系21B 的叶片及花蕾(不同大小花蕾的混合样品)cDNA 为模板，利用CMS721、CMS394和CMS285特异引物对其进行扩增，内参Actin1基因为对照。扩增结果显示，CMS721、CMS394和CMS285基因只在不育系21A 中表达。图4为CMS721基因在21A 及21B 中的表达情况，发现只在21A 中扩增出大小750 bp 左右的特异条带，而在相应的保持系中则无此条带，说明经mtDNA-SRAP获得的基因CMS721、CMS394和CMS285确实与辣椒细胞质雄性不育性存在相关性。

图4 CMS721基因在不育系21A 及保持系21B 中的表达Fig.4 Expression of CMS721 in CMS line 21A and its maintainer line 21B

2.4 CMS721、CMS394、CMS285基因的荧光定量分析

为了明确CMS721、CMS394和CMS285与辣椒细胞质雄性不育性之间的紧密程度，利用qRT-PCR 技术对上述基因在辣椒细胞质雄性不育系21A 盛花期7个不同组织(根、茎、叶、微花蕾、小花蕾、中花蕾和大花蕾)中的转录表达水平进行了分析。参照Wang 等［20］方法建立标准曲线，为:Y= -3.401 1x+46.611 6，相关系数为0.999 5，起始模板浓度与Ct值之间呈良好的线性关系。结果表明:CMS721、CMS394和CMS285基因在所检测的不育系材料21A 所有组织中均有表达，组织表达的熔解曲线结果显示为单峰，且峰值单一，说明产物特异性好。

图5 为采用2(-△Ct)法和10△△CT/A法根据Ct值计算出辣椒细胞质雄性不育系21A 不同组织中CMS721基因的相对表达量。虽然这两种方法计算的结果不一致，存在量的差别，但是其表达变化趋势却是一致的。从图5 中可以看出，CMS721在不育系21A 7 个不同组织中的表达量存在显著差异，尤其在中花蕾中，CMS721的表达量急剧下降。Luo等［12］研究结果表明，辣椒细胞质雄性不育系21A 花粉败育主要发生在单核靠边期，对应的花药发育阶段为中花蕾时期，进而推论CMS721基因是引起辣椒21A 花粉败育的直接原因，但还需转基因手段的进一步验证。此外，荧光定量分析表明CMS394和CMS285基因在辣椒细胞质雄性不育系21A 的小花蕾和中花蕾中的表达量也呈下降趋势。

3 讨论

国内外对雄性不育基因的作用机制开展了广泛的研究，通常认为细胞质雄性不育的发生是由于线粒体基因组分子内或分子间发生频繁重组，从而产生新的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，导致线粒体功能发生紊乱，致使小孢子发育过程中能量供应不足，进而导致雄性不育［13-14，21］。通过对多种作物的不育系和保持系的研究发现，与CMS 有关的基因或片段均位于线粒体基因组中，并克隆得到一些与雄性不育相关的线粒体候选基因［22-25］。辣椒上已鉴定分离出2 个线粒体基因orf456和atp6［9-10］，对它们的研究发现，其是雄性不育性相关的重要候选基因。本研究以辣椒细胞质雄性不育系21A 及相应保持系21B 的线粒体DNA 为材料进行SRAP 分析，获得了3 个与能量代谢相关的基因片断，其中差异基因片断CMS721与已报道的辣椒雄性不育相关候选基因F0-ATPase subunit(atp6)gene 及ATP synthase subunit 6-2(atp6-2)同源性都高达99%［9］。推论本研究利用的辣椒细胞质雄性不育系21A 的不育性可能与CMS721相关，其不育机理可能与atp6具有相同或相似的败育机理。说明从线粒体DNA 角度出发，更能有效地挖掘出与辣椒雄性不育相关的候选基因。

图5 CMS721在辣椒细胞质雄性不育系21A 不同组织中的相对表达水平Fig.5 Relative expression levels of CMS721 in different tissues of CMS line 21A

关于辣椒细胞质雄性不育的细胞学特征前人已做了一定的研究。Kim 等［10］通过电镜观察到不育植株处于小孢子阶段的花粉囊中含有空泡的花粉粒。王述彬等［26］研究结果表明辣椒细胞质雄性不育系21A 在雄配子发育过程中，绒毡层细胞中的线粒体空泡化，结构异常，导致雄性不育。Luo 等［12］对辣椒细胞质雄性不育系败育的细胞学机理研究结果表明，不育系21A 和保持系21B 都能进行正常的减速分裂，保持系的四分孢子经过单核和双核花粉等发育时期后能形成成熟花粉粒，而不育系从单核靠边期开始在花粉壁上形成突起，崩出内含物，致使不育系雄配子在双核花粉粒形成之前就完全裂解，不能发育成正常的花粉粒。

本研究中CMS721基因与已发表的雄性不育候选基因atp6相似性较高，荧光定量分析结果表明CMS721基因在盛花期中花蕾的表达量急剧下降，我们推测CMS721基因控制辣椒花药中与能量代谢相关的蛋白质合成，在中花蕾时期，该基因表达受阻，影响呼吸链和正常的电子传递，影响线粒体的正常生理功能，营养和能量供应不足，引起小孢子败育进而导致雄性不育。至于CMS721是如何以直接或者间接方式导致雄性不育，以及CMS721的表达与CMS发生的直接分子证据仍需进行深入的研究。

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