NHEJ信号通路关键基因mRNA表达与宫颈鳞癌同步放化疗敏感性的关系

许义松，周文静，祁晓丽，席 佩，戴鹏高

(西北大学生命科学学院，陕西西安 710069)

宫颈癌是常见的一种女性恶性肿瘤，全世界每年新增45万～50万例患者，其中鳞癌为最常见的病理类型。在我国，近十几年来宫颈癌的发病率和死亡率呈现升高的趋势［1-2］。目前，将放射治疗及以顺铂为基础的化学药物治疗相结合的治疗方式，已成为临床上治疗的IIB期及以上分期宫颈癌的标准方法，通常称之为同步放化疗。相对于传统的单独放疗及其他治疗手段，接受同步放化疗的患者群体拥有更长的生存期及更为轻微的毒副作用。然而，仍有相当一部分患者无法从中受益［3-4］。因此，发现与宫颈癌放化疗敏感性的分子标志物具有重要意义。

同步放化疗主要通过诱发各种类型的DNA损伤来达到治疗肿瘤的效果，其中DNA双链断裂(DNA double strand break，DSB)损伤与杀死肿瘤细胞密切相关［5］。细胞通过激活 NHEJ和 HR(homologous recombination)信号通路修复DSB损伤，其中NHEJ是主要的修复途径［6-9］。肿瘤细胞的NHEJ系统与细胞生存密切相关，因此也是放化疗敏感性的重要决定因素。多项研究表明，NHEJ信号通路中关键信号转导基因的表达与乳腺癌［10］、鼻咽癌［11］、咽喉癌［12］等恶性肿瘤的放/化疗敏感性密切有关。本研究主要探索NHEJ信号通路中关键基因 XRCC4，XRCC5，XRCC6，LIG4，PRKDC和DCLRE1C的mRNA表达水平与宫颈鳞癌患者同步放化疗敏感性的关系，进而找到预测宫颈鳞癌同步放化疗敏感性的分子标志物。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取42名于2013年11月至2014年5月在西安交通大学第一附属医院收治的宫颈鳞癌患者。所有组织样本均为治疗前的活检标本，并且病理检查均为鳞癌;依据国际妇产科联盟(The International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)制定的宫颈癌国际临床分期标准进行临床分期。临床分期为:ⅠB～ⅢB期，其中ⅠB期1例，ⅡA期1例，ⅡAⅡ期3例，ⅡB期15例，ⅢB期22例);在42例样本中有34例样本属于中分化程度，高分化程度有3例，低分化程度有5例;年龄47～78岁，中位年龄60岁。本实验通过西安交通大学第一附属医院伦理委员会批准并征求所有参与患者同意。

42例患者均接受同步放化疗治疗。具体放疗方案为:采用调强适形放射治疗行全盆腔体外照射，每次2Gy，每周5次，总剂量为50Gy，同时加以腔内近距离照射，每周4～5次，A点总剂量为24～25Gy。同步化疗方案为:在放疗期间采用静脉滴注方式给予顺铂40 mg/m2，每周1次，共6周。

1.2 仪器与试剂

ABI PRISM®7500 Real Time PCR System(Life);Nanodrop核酸定量仪(Thermo Forma);TRIzol试剂(Invitrogen);一步法RT-PCR试剂盒(TaKaRa);引物及探针(上海生工生物有限公司合成)。

1.3 实验方法

1.3.1 组织中总RNA的提取 用TRizol法提取新鲜冰冻穿刺组织中总RNA，每50～100 mg匀浆组织中加入1 mL Trizol。用Nanodrop紫外分光光度仪测定RNA的浓度及纯度，并通过0.01g/mL琼脂糖凝胶鉴定RNA的完整性。

1.3.2 引物设计 从Genebank数据库中查找并下载 XRCC4，XRCC5，XRCC6，LIG4，PRKDC，DCLRE1C及GAPDH基因的mRNA序列。选择欲设计引物探针的位置，然后将该位置的序列导入Primer Express 5.0软件，进行引物和探针的设计。利用Primer Blast在线软件对引物特异性进行评估。引物探针序列见表1。

1.3.3 荧光定量PCR检测 反应体系配置如下:每个反应体系体积为20 μL，其中上下游引物用量为500 nmol/L，荧光探针为200 nmol/L，RNA模板为50 ng，TaKaRa Ex Taq HS为2 U，One Step RT-PCR BufferⅢ为10 μL，PrimeScript RT enzyme MixⅡ为 0.4 μL，Rox Reference Dye Ⅱ(50 ×)为0.4 μL，无 Rnase 超纯水补足至20 μL。反应程序分两步，第一步，42℃持续5 min，95℃持续10s;第二步，95℃持续5s，60℃持续34s，40 个循环。每一个反应做两个平行反应，最后取平均值。每个目的基因的表达值均以GAPDH为内参基因进行标准化，计算公式为2-△Ct，其中△Ct=目的基因Ct-内参基因Ct。实验中6个基因及内参基因(GAPDH)的扩增曲线图，见图1。

表1 7个基因的引物及探针序列Tab.1 Primer and probe sequences of seven genes

图1 7个基因的扩增曲线图Fig.1 The amplification figure of seven genes

1.4 患者对同步放化疗敏感性评定标准

患者同步放化疗结束3个月后进行复查，并根据实体瘤疗效评定标准对临床疗效进行划分:1)完全缓解(complete response，CR)——所有靶病灶完全消失;2)部分缓解(partial response PR)——所有靶病灶最大径之和减小≥30%;3)疾病进展(progressive disease，PD)——靶病灶最大径之和增加≥20%或有新的病灶出现;4)疾病稳定(stable disease，SD)——靶病灶最大径之和的变化介于PR和PD之间［13］。将近期疗效CR患者视为对同步放化疗有应答，近期疗效PR，SD和PD患者视为对同步放化疗无应答。

1.5 统计学分析

用SPSS 17.0软件进行统计学分析，用χ2检验分析各基因mRNA表达水平与同步放化疗敏感性之间的关系，用Logistic回归进一步分析同步放化疗敏感性相关因素。当P＜0.05时，有统计学意义上的显著差异。

2 结果

2.1 XRCC4，XRCC5，XRCC6，LIG4，PRKDC和DCLRE1C mRNA表达与宫颈鳞癌同步放化疗敏感性的关系

据实体瘤疗效评定标准，42例患者对同步放化疗有应答的为29例，无应答的为13例。用每个基因mRNA表达值的中位值来定义其表达水平，其中mRNA表达值≥中位值计为高表达，mRNA表达值＜中位值则计为低表达。6个基因的mRNA表达水平与同步放化疗敏感性之间的关系，见表2。结果表明，XRCC6 mRNA高表达的患者在CR组和PR+SD+PD组中分别占34.5%和84.6%，XRCC6 mRNA低表达患者在CR组和PR+SD+PD组中分别占65.5%和15.4%(P=0.003)。在 XRCC4，LIG4，XRCC5，PRKDC 及DCLRE1C mRNA高表达组和低表达组中，患者应答率没有显著差异(P＞0.05)。

2.2 宫颈鳞癌同步放化疗敏感性相关因素Logistic回归分析

将患者的临床信息与XRCC6 mRNA表达一起纳入Logistic多因素回归分析。结果显示，只有XRCC6表达水平与放化疗敏感性有显著性关联，而患者的年龄、瘤块大小和FIGO分期则与患者的临床疗效无关，XRCC6高表达是降低同步放化疗敏感性的独立危险因素(OR 10.694，95%CI 1.872～61.094;P=0.008)，见表3。

表2 NHEJ信号通路关键基因mRNA表达与宫颈鳞癌同步放化疗敏感性的关系Tab.2 The relationship between mRNA levels of genes involved in the NHEJ pathway and concurrent chemoradiotherapy sensitivity in squamous cell cervical cancer

表3 宫颈鳞癌同步放化疗敏感性相关因素Logistic回归分析Tab.3 Logistic regression analysis of influential factors on synchronous chemoradiotherapy sensitivity in squamous cell cervical carcinoma

3 讨论

NHEJ信号通路可以修复由同步放化疗引发的DSB损伤［6］。由于其修复过程不需要同源DNA模板，可以发生在整个细胞周期中，是修复DSB 的 主 要 信 号 通 路［8-9］。XRCC4，XRCC5，XRCC6，LIG4，PRKDC和DCLRE1C参与整个修复过程，这些关键基因的表达水平会影响该通路的功能，因而可以进一步影响细胞对放化疗的敏感性。本研究通过qRT-PCR法测定42例宫颈鳞癌患者 XRCC4，XRCC5，XRCC6，LIG4，PRKDC和DCLRE1C的mRNA表达值，在应答组的29例样本中，XRCC4 PRKDC分别有1例样本未检测出表达值。经统计发现，XRCC6的mRNA表达水平与患者接受同步放化疗治疗的敏感性密切相关，XRCC6低表达患者对同步放化疗敏感，且近期疗效更好。

XRCC6编码的Ku70蛋白是NHEJ信号通路中最重要的信号转导因子之一［14-15］。DSB发生时，Ku复合物(Ku70和Ku80)识别并结合到DSB末端，并为该通路中其他修复蛋白的结合提供支架［16］。大量研究表明，肿瘤细胞中Ku70表达与放化疗抵抗有密切的关系。采用基因敲除技术去除小鼠胚胎干细胞中XRCC6基因，建立XRCC6基因敲除鼠动物模型，小鼠表现出对电离辐射异常敏感和生长迟缓等现象［17］。体外研究发现，通过向人宫颈癌HeLa细胞系转染靶向抑制Ku70的ShRNA来抑制细胞系Ku70蛋白表达，可以显著提高细胞的对化疗药物的敏感性［18］。最近用免疫组化法检测治疗前、后IB-IIA期宫颈癌组织中Ku70蛋白表达，发现Ku70的表达量在放疗残留组织中增加［19］。本实验与相关研究报道的结果一致，提示XRCC6 mRNA表达水平升高可导致Ku70蛋白表达增加及NHEJ修复能力增强，最终引起对同步放化疗的反应降低。XRCC4，XRCC5，LIG4，PRKDC和DCLRE1C基因与肿瘤的放化疗敏感性未发现存在显著相关性。一方面可能是由于XRCC6引起的放化疗敏感性是通过其他细胞信号通路影响细胞的生长;另一方面所用的样本量偏小，尚未能发现这些基因与肿瘤放化疗敏感性。由于研究的样本都为穿刺组织，组织量少，因此本实验只是在RNA水平上来验证，且样本量非常有限，更加可靠性的结论需要大样本研究验证。

综上所述，NHEJ信号通路中XRCC6 mRNA表达水平与宫颈鳞癌患者接受同步放化疗治疗的敏感性密切相关。在患者进行治疗之前，先对其活检组织中XRCC6 mRNA表达水平进行检测，这样就能有效地预测其临床疗效。

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