亚麻籽中木脂素及其水解产物的分离、鉴定和抗氧化活性

李 欣，何 敏，袁建平，王江海,*

（1.广东科贸职业学院生物技术系，广东 广州 510430；2.中山大学海洋学院，广东省海洋资源与近岸工程重点实验室，广东 广州 510006）

亚麻籽中木脂素及其水解产物的分离、鉴定和抗氧化活性

李 欣1,2，何 敏1，袁建平2，王江海2,*

（1.广东科贸职业学院生物技术系，广东 广州 510430；2.中山大学海洋学院，广东省海洋资源与近岸工程重点实验室，广东 广州 510006）

采用快速柱层析和制备薄层色谱相结合的新方法，从亚麻籽中分离木脂素开环异落叶松脂酚二糖苷和对香豆酸苷甲酯。同时发现，亚麻籽开环异落叶松脂酚二糖苷在酸水解时除生成开环异落叶松脂酚和无水开环异落叶松脂酚，还部分转化为开环异落叶松脂酚单糖苷。从亚麻籽的酸水解产物中分离出6个化合物，分别鉴定为：开环异落叶松脂酚单糖苷、开环异落叶松脂酚、无水开环异落叶松脂酚、对香豆酸甲酯、阿魏酸甲酯和5-羟甲基糠醛；其中对香豆酸苷甲酯、对香豆酸甲酯和阿魏酸甲酯为首次从亚麻籽水解产物中分离获得，分别由对香豆酸苷、对香豆酸和阿魏酸在水解时与甲醇发生酯交换形成。体外抗氧化测试结果表明，开环异落叶松脂酚二糖苷、开环异落叶松脂酚单糖苷和开环异落叶松脂酚对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羟自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O2-·）均具有清除作用，且呈明显的量效关系。

亚麻籽；木脂素；水解产物；抗氧化活性

木脂素是植物中广泛存在的酚类化合物，是植物雌激素中的一类[1-2]。在所有谷物、豆类、蔬菜和水果中，亚麻籽（Linum usitatissimum）木脂素开环异落叶松脂酚（secoisolariciresinol，SECO）含量最高[3-4]。SECO在肠道微生物作用下可代谢为动物雌激素肠二醇和肠内脂[5-6]。木脂素具有降低血清胆固醇及减少Ⅱ型糖尿病、乳腺癌、前列腺癌和直肠癌等发病风险的生物活性[7-10]。亚麻籽中的SECO与糖苷结合，以开环异落叶松脂酚二糖苷（secoisolariciresinol diglucoside，SDG）形式存在，SDG与3-羟基-3甲基戊二酸、对香豆酸苷、阿魏酸苷和草棉素糖苷等结合形成分子质量约为4 000 D的SDG聚合物[4,11-12]。亚麻籽木脂素在分离提取时需通过水解将其酯键和糖苷键打断[13-15]。SDG聚合物在碱水解后，SDG会游离出来，然后通过酸水解或酶水解使糖苷键断裂，从SDG中释放出SECO；在酸性条件下，SECO中相邻的两个羟基会发生缩合而脱去一个水分子，生成无水开环异落叶松脂酚（anhydrosecoisolariciresinol，ASECO）[2,16]。研究发现，开环异落叶松脂酚单糖苷（secoisolariciresinol monoglucoside，SMG）是SDG在人类肠道微生物作用下脱掉糖苷生成SECO过程中的中间产物[4]；然而，在酸水解时是否产生SMG则未见报道。分离纯化亚麻籽中木脂素的方法目前主要有反相高效液相制备色谱、高速逆流色谱、固相萃取和柱色谱等[11,17-20]。本实验采用快速柱层析分离（flash columnar chromatography，FCC）和制备薄层色谱（preparative thin layer chromatography，PTLC）相结合的方法，从亚麻籽粉中分离制备了SDG纯品。并对亚麻籽木脂素酸水解产物进行了分离和结构鉴定，明确了化合物间的转化关系。通过测定SDG及其酸水解产物SMG、SECO、ASECO的体外抗氧化活性，为亚麻籽木脂素的高效利用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

亚麻籽粉（含SDG约40%） 湖南德瑞生物产业集团有限公司。

SECO（纯度95%）、5-羟甲基糠醛（纯度95%）美国Sigma-Aldrich公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海晶纯实业有限公司；邻苯三酚（焦性没食子酸）、邻二氮菲 上海国药集团化学试剂有限公司；Tris-HCl生工生物工程（上海）股份有限公司；硅胶H（薄层层析用，粒度10～40μm） 青岛海洋化工厂；可剪截型薄层层析板（铝基硅胶G板） 天津市天河医疗有限公司；C18柱（500 mg/3 mL） 美国Supelco公司；PTLC板：玻璃板（20 cm×20 cm，2 mm）铺10 g活化后的硅胶，硅胶层厚度约0.5 mm；制备柱（Φ＝20 mm，L= 30 cm）。

1.2仪器与设备

Alpha 1-4真空冷冻干燥仪 香港HUA-YEE仪器公司；Varian INOVA 500NB傅里叶变换超导核磁共振谱仪 美国Varian公司；双聚焦磁质谱仪 英国VG公司；Muhiskan Spectrum全波长酶标仪 美国赛默飞世尔科技公司；732N紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；Heidolph-4001旋转蒸发仪 北京博励行仪器有限公司；SHZ-D（III）循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂。

1.3亚麻籽碱水解产物的提取

称取10 g亚麻籽粉，加入60 mL体积分数为70%的甲醇水溶液后提取3次；提取液合并后浓缩至约20 mL时进行碱水解（反应液NaOH浓度约为20 mmol/L）；在50℃水浴中保持1 h后，用醋酸调节pH值至5.0；低温浓缩，加入无水硫酸钠静置过夜后，用甲醇洗涤回收；提取液经减压浓缩得到5.6 g浸膏，见图1。取适量用少量乙醇溶解后，加入4倍量的硅胶吸附，再进行FCC。依次用150 mL乙酸乙酯-乙醇（8.5∶1.5，V/V）、100 mL乙酸乙酯-乙醇（8∶2，V/V）和50 mL乙酸乙酯-乙醇（7∶3，V/V）的混合溶液梯度洗脱，每20 mL洗脱液收集一管，分离过程用薄层色谱法监控，合并组成类似的收集物，用PTLC纯化（展开剂：乙酸乙酯-乙醇8∶2，V/V），纯化后的样品经浓缩后进行冷冻干燥，得到2个化合物；其中化合物A为2.6 g，化合物B为290 mg。

1.4亚麻籽粉提取液水解产物的纯化和鉴定

称取20 g亚麻籽粉的甲醇提取物，加25 mL水溶解，碱水解后，在1 mol/L HCl条件下，于95℃水浴中振荡3 h；再用乙酸乙酯萃取3次，收集水相用C18柱纯化；甲醇洗脱回收SMG后，用PTLC纯化[展开剂：乙酸乙酯-乙醇（8.5∶1.5，V/V）]，得到化合物1为白色固体，其质量约44 mg。有机相合并浓缩后，再用硅胶吸附、上样；采用FCC分离，分别用乙酸乙酯-石油醚（5∶5，V/V），乙酸乙酯-石油醚（8∶2，V/V）和乙酸乙酯淋洗，收集合并组分类似的收集液；采用FCC和PTLC纯化，得到化合物2（38 mg）、化合物3（47 mg）、化合物4（17 mg）、化合物5（14 mg）和化合物6（13 mg）5个化合物。过程见图1。

图1 亚麻籽SDG及主要水解产物提取路线Fig.1 Separation procedures of SDG and the main hydrolysates from flaxseeds

1.5 SDG及其酸水解产物的抗氧化活性测定

参照周先丽等[21]方法，采用酶标仪微量法和紫外-可见光分光光度法，以VC为阳性对照，分别测定SDG及其酸水解产物SMG、SECO和ASECO对DPPH自由基、羟自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O2-·）的清除能力。上述实验均设3次重复，计算清除率和半数清除率（IC50，Logit法计算）。

2 结果与分析

2.1亚麻籽碱水解产物的分离

刘大川等[18]采用硅胶柱层析甲醇-氯仿-冰醋酸混合溶剂洗脱分离木脂素。为了提高提取效率和木脂素的纯度，本实验采用乙酸乙酯-乙醇梯度洗脱FCC分离、PTLC纯化亚麻籽木脂素SDG。通过液相色谱测定SDG峰面积占总峰面积的比例，确定SDG的纯度约为96%。结合核磁共振和质谱分析结果，对SDG的结构进行了确认。该方法所需的仪器简单，提取试剂无毒、无污染，提高了木脂素分离方法的安全性并降低了成本。

化合物A：白色无定形粉末；FAB-MSm/z686[M]+；1H NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.59（2H，d，J= 1.8 Hz，H-2, 2’），6.64（2H，d，J= 8.0 Hz，H-5, 5’），6.56（2H，dd，J= 1.8,8.0 Hz，H-6, 6’），2.61（2H，dd，J= 7.9,13.8 Hz，H-7, 7’a），2.68（2H，dd，J= 6.9,13.8 Hz，H-7, 7’b），2.12（2H，m，H-8, 8’），4.06（2H，dd，J= 5.6,9.9 Hz，H-9, 9’a），3.47（2H，dd，J= 6.4,9.9 Hz，H-9, 9’b），3.73（3H，s，OCH3），4.23（2H，d，J= 7.8 Hz，H-1a,1a’），3.21（2H，t，J= 7.8,9.0 Hz，H-2a, 2a’），3.25（2H，m，H-5a, 5a’），3.84（2H，brd，J= 2.3,11.8 Hz，H-6a-a/6a’-a），3.68（2H，dd，J= 5.5,11.8 Hz，H-6a-b/6a’-b）。以上数据与文献[15]报道的波谱数据一致，确定化合物A为SDG。

化合物B：白色无定形粉末；FAB-MSm/z343[M-H]+；1H NMR（CDCl3, 500 MHz）δ：7.55（1H，d，J= 8.7 Hz，H-2），7.12（2H，d，J= 8.8 Hz，H-3,5），7.55（1H，d，J= 8.6 Hz，H-6），7.65（1H，d，J= 15.8 Hz，H-7），6.41（1H，d，J= 16.0 Hz，H-8），3.77（3H，s，OCH3），4.844（1H，s，Aro-OH），4.96（1H，d，J= 7.3 Hz，H-1a），3.70（1H，dd，J= 2.8,10.4 Hz，H-6a），4.96（1H，dd，J= 2.4,9.8 Hz，H-6b）。根据1H-NMR和质谱分析结果，确定化合物B为Methyl CouAG。

研究表明，亚麻籽中的SDG与3-羟基-3甲基戊二酸连接构成亚麻籽多聚体结构的链状骨架；对香豆酸苷和阿魏酸苷分别以酯键连接在该多聚体骨架上[4,22]。CouAG甲酯的形成说明碱水解后多聚体酯键断裂，并使对香豆酸苷和阿魏酸苷的糖苷配基的—COOH基团暴露出来，与反应液中的甲醇发生酯交换，生成CouAG甲酯和阿魏酸苷甲酯。

2.2亚麻籽粉提取液酸水解产物的分离

SDG在体内的代谢需借助特定的肠道菌群。若体内缺失该菌群，则SDG不能被人体吸收利用。因此，对亚麻籽木脂素酸水解产物的鉴别非常必要，且具有重要的应用价值，有助于寻找更易吸收利用的木脂素衍生物。本实验对亚麻籽粉的酸水解液进行了分离鉴定。水解液用乙酸乙酯萃取后，分别从水相和有机相中分离得到6种化合物，化合物结构如图2所示。

化合物1：白色无定形粉末；其结构参数为：FAB-MSm/z524[M]+；1H NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.60（1H，d，J= 1.8 Hz，H-2），6.60（1H，d，J= 1.8 Hz，H-2’），6.65（2H，d，J= 7.9 Hz，H-5, 5’），6.56（1H，dd，J= 1.9,5.3 Hz，H-6），6.54（1H，dd，J= 2.0,5.3 Hz，H-6’）, 2.67（1H，dd，J= 7.3,13.6 Hz，H-7b），2.10（1H，m，H-8），1.94（1H，m，H-8’），4.05（1H，dd，J= 6.1,9.8 Hz，H-9a），3.47（1H，dd，J= 6.2,9.9 Hz，H-9b），3.64（1H，dd，J= 6.4,11.2 Hz，H-9’a），3.55（1H，dd，J= 6.0,11.0 Hz，H-9’b），4.21（1H，d，J= 7.8 Hz，H-1a），3.20（1H，t，J= 7.9,9.0 Hz，H-2a），3.23（1H，m，H-5a），3.84（1H，dd，J= 2.4,11.9 Hz，H-6a-a），3.68（1H，dd，J= 5.6,11.9 Hz，H-6a-b），3.74（3H，s，OCH3）；13C NMR（CD3OD，500 MHz） δ：134.0（C-1），133.8（C-1’），113.5（C-2），113.5（C-2’），148.7（C-3/3’），145.4（C-4/4’），115.7（C-5/5’），122.8（C-6），122.8（C-6’），35.9（C-7b），35.9（C-7a），35.5（C-7’a，7’b），41.4（C-8），43.9（C-8’），71.1（C-9a），71.1（C-9b），62.6（C-9’a），62.6（C-9’b），104.7（C-1a），75.2（C-2a），78.2（C-3a），71.7（C-4a），77.9（C-5a），62.8（C-6a-a），62.8（C-6a-b）和56.2（OCH3）。根据1H-NMR和13C-NMR谱及质谱（fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS）数据，确定化合物1为SMG。Clavel等[5]发现，梭状芽孢杆菌能使SDG脱去2个糖基形成SECO和脱去1个糖基形成SMG，本研究表明，在酸水解时SDG也能部分脱去糖基生成SMG。

化合物2：白色无定形粉末；与SECO标准品的多个溶剂系统进行薄层色谱鉴别，发现两者的薄层色谱斑点Rf一致。用硫酸-乙醇显色均呈蓝色，结合1H-NMR谱和FAB-MS分析结果，确定化合物2为SECO。其结构参数为：FAB-MSm/z362[M]+；1H NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.59（2H，d，J= 1.9 Hz，H-2, 2’），6.66（2H，d，J= 7.9 Hz，H-5, 5’），6.54（2H，dd，J= 1.9,7.9 Hz，H-6, 6’），2.56（2H，dd，J= 7.5,13.7 Hz，H-7,7’a），2.66（2H，dd，J= 6.8,13.8 Hz，H-7, 7’b），1.90（2H，brd，J= 6.1 Hz，H-8, 8’），3.58（2H，m，H-9,9’a），3.31（2H，m，H-9,9’b），3.74（3H，s，OCH3）。

化合物3：白色无定形粉末；其结构参数为：FABMSm/z344[M]+；1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ：6.84（2H，d，J= 1.7 Hz，H-2, 2’），7.13（2H，d，J= 8.0 Hz，H-5, 5’），6.92（2H，dd，J= 1.7,8.0 Hz，H-6, 6’），2.85（2H，dd，J= 7.8,13.8 Hz，H-7,7’a），2.92（2H，dd，J= 6.6,13.7 Hz，H-7,7’b），2.50（2H，m，H-8, 8’），4.25（2H，dd，J= 6.5,8.6 Hz，H-9,9’a），3.86（2H，dd，J= 5.6,8.7 Hz，H-9,9’b），4.16（3H，s，OCH3）。数据与文献报道[8]数据一致，确定化合物3为ASECO。

化合物4：白色无定形粉末；其结构参数为：FAB-MSm/z179[M-H]+；1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.54（1H，d，J= 8.6 Hz，H-2），6.89（1H，d，J= 8.7 Hz，H-3），6.89（1H，d，J= 8.7 Hz，H-5），7.54（1H，d，J= 8.6 Hz，H-6），7.60（1H，d，J= 16.0 Hz，H-7），6.34（1H，d，J= 16.0 Hz，H-8），3.72（3H，s，OCH3）。1H-NMR谱和质谱分析结果表明，化合物4为Methyl CouA。

化合物5：白色无定形粉末；其结构参数为：FAB-MSm/z209[M-H]+；1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.32（1H，d，J= 8.6 Hz，H-2），6.87（1H，d，J= 8.7 Hz，H-5），7.14（1H，dd，J= 2.0,8.2 Hz，H-6），7.59（1H，d，J= 15.9 Hz，H-7），6.39（1H，d，J= 15.9 Hz，H-8），3.72（3H，s，OCH3），3.91（3H，s，AroOCH3）。1H-NMR谱和质谱分析结果表明，化合物5为Methyl FeA。

化合物6：白色无定形粉末；与5-HMF标准品的多个溶剂系统进行薄层色谱鉴别，发现两者的薄层色谱斑点Rf一致。用硫酸-乙醇显色均呈蓝色，确定化合物6为5-HMF。5-HMF是己糖在酸性条件下的降解产物[23]。在SDG多聚体中含大量葡萄糖残基[24]。前人在亚麻籽提取物中也曾分离出蔗糖[25]。5-HMF可能是亚麻籽中的己糖（如蔗糖等）或糖苷中的葡萄糖残基经酸水解形成的。

图2 亚麻籽中SDG及其主要水解产物的结构Fig.2 Structures of SDG and its hydrolysates from flaxseeds

2.3 SDG及其酸水解产物的抗氧化活性

图3 SDG、SMG、SECO和ASECO对DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging capability of SDG, SMG, SECO and ASECO against DPPH free radical

由图3可知，SDG及其酸水解产物SMG、SECO和ASECO对DPPH自由基的清除率随着质量浓度增加而增加，呈明显量效关系，IC50分别为2.85、3.32、2.75 mg/L和4.86 mg/L（对照VC的IC50为3.34 mg/L）；对·OH的清除作用随着质量浓度的增大，清除作用不断增大（图4），IC50分别为11.11、11.59、10.82 mg/L和19.88 mg/L（对照VC的IC50为11.90 mg/L）；对O2-·的清除能力同样呈明显的量效关系（图5），IC50分别为7.40、8.25、6.91 mg/L和16.85 mg/L（对照VC的IC50为8.40 mg/L）。由此可见，木脂素SDG、SECO和SMG能够有效清除自由基，具有较强的抗氧化活性。

图4 SDG、SMG、SECO和ASECO对·OH的清除作用Fig.4 Scavenging capability of SDG, SMG, SECO and ASECO against hydroxyl free radical

图5 SDG、SMG、SECO和ASECOO对的清除作用Fig.5 Scavenging capability of SDG, SMG, SECO and ASECO against superoxide anion radical

3 结 论

采用快速柱层析分离和制备薄层色谱相结合的方法，从亚麻籽粉中分离制备SDG，纯度高，所用试剂无毒、无污染，提高了分离纯化工艺的安全性和经济性。研究发现亚麻籽SDG在酸水解时除生成SECO和ASECO外，还会部分脱糖苷转化为SMG。另外本实验从水解产物中分离出对香豆酸苷甲酯、对香豆酸甲酯和阿魏酸甲酯，它们分别是亚麻籽多聚体中的对香豆酸苷、对香豆酸和阿魏酸在水解时游离，并与甲醇发生酯交换形成的。体外抗氧化活性研究表明，亚麻籽SDG及其酸水解产物SMG、SECO、ASECO在体外均有较好的抗氧化活性，且呈明显的量效关系。有学者认为亚麻籽木脂素的抗肿瘤活性与它的抗氧化活性密切相关，需进一步明确亚麻籽木脂素成分在体内的转化及其抗氧化活性。

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Separation, Identification and Antioxidant Activities of Lignans and Their Hydrolysates in Flaxseeds

LI Xin1,2, HE Min1, YUAN Jianping2, WANG Jianghai2,*(1. Department of Biotechnology, Guangdong Vocational College of Science and Trade, Guangzhou 510430, China; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Marine Resources and Coastal Engineering, School of Marine Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510006, China)

In the present study, secoisolariciresinol diglucoside andp-coumaric acid methyl ester were separated from flaxseeds by a novel method combining flash column chromatography with preparative thin layer chromatography. Secoisolariciresinol diglucoside was transformed into secoisolariciresinol and anhydrosecoisolariciresinol or into secoisolariciresinol monoglucosides during the acid hydrolysis. Six compounds were isolated from the acid hydrolysates of flaxseeds, and were respectively identified as secoisolariciresinol monoglucoside, secoisolariciresinol, anhydrosecoisolariciresinol,p-coumaric acid methyl ester, ferulic acid methyl ester, and 5-hydroxymethyl-2-furfural on the basis of their spectral data.p-Coumaric acid glucoside methyl ester,p-coumaric acid methyl ester and ferulic acid methyl ester were separated for the first time from the flaxseed hydrolysates, which were produced by the transesterification ofp-coumaric acid glucoside,p-coumaric acid, and ferulic acid with methanol in hydrolysis. Interestingly, secoisolariciresinol diglucoside, secoisolariciresinol monoglucoside, and secoisolariciresinol had scavenging capabilities against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical, hydroxy radical and superoxide aion radicals, and had a good dose-effect relationship between their concentrations and antioxidant activities.

flaxseed; lignans; hydrolysates; antioxidant activities

TS201.2

1002-6630（2015）17-0099-05

10.7506/spkx1002-6630-201517019

2014-11-30

教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目（20090171110015）；广东省科技攻关计划项目（2013B020311005）

李欣（1980—），女，副教授，博士，研究方向为天然产物分离与应用。E-mail：lylx08@126.com

*通信作者：王江海（1965—），男，研究员，博士，研究方向为海洋生物学。E-mail：wangjhai@mail.sysu.edu.cn