苦荞总皂苷的提取工艺优化

智秀娟 李 栋 曹新杰 丁 轲 马挺军

（中国农业大学工学院1，北京 100083）

（北京农学院食品科学与工程学院农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室食品质量与安全北京实验室2，北京 102206）

苦荞总皂苷的提取工艺优化

智秀娟1，2李 栋1曹新杰2丁 轲2马挺军2

（中国农业大学工学院1，北京 100083）

（北京农学院食品科学与工程学院农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室食品质量与安全北京实验室2，北京 102206）

为了确定热回流法提取苦荞总皂苷的最佳提取工艺条件，采用响应曲面分析方法，研究提取温度、提取时间、液固比、乙醇体积分数及其交互作用对苦荞总皂苷提取效果的影响。用SAS及Design expert软件确定了苦荞总皂苷的最佳提取工艺参数为：乙醇体积分数69.51%，液固比12.37 mL／g，提取温度50.7℃，提取时间63.24 min，总皂苷得率最大值为22.82 mg／g。同一条件下进行验证试验，实际测得的平均得率为（22.54±0.31）mg／g（n＝3），试验数据稳定，说明回归模型能较好地预测苦荞中总皂苷的提取得率。

苦荞 皂苷 回流提取 响应曲面法

荞麦是蓼科荞麦属的双子叶假禾本科一年生草本植物，多生长于高海拔高寒山区，耐寒、耐旱、耐贫瘠，生长周期短，当年可多次播种多次收获，是中国、印度、俄罗斯等众多国家的传统耕种作物，可用作绿肥、饲料及预防水土流失的覆盖作物［1］。荞麦在世界各地有很多种植品种，据FAO统计，2009年世界范围内荞麦的种植面积超过2×106hm2，产量高达约1.78×106t［2］，其中2个最主要的品种是苦荞（Fagopyrum tataricum）和甜荞（Fagopyrum esculentum）。由于营养价值丰富，荞麦作为小麦、大米、玉米等大宗粮食作物的替代作物目前备受关注。

苦荞富含生物类黄酮、糖醇、D-手性肌醇、花青素等高活性功能成分，在抗肿瘤、抗氧化、抗衰老和清除自由基、防治心脑血管疾病，降低血液与肝脏胆固醇，抑制脂肪积累，改善便秘，抑制大肠癌和胆结石，改善胰岛功能，调节血糖、改善微循环等方面效果显著。目前已有许多关于荞麦籽粒中蛋白质［3-6］、黄酮［7-9］、酚酸［5，10-11］、生 育 酚［5，12-14］、植 物 甾 醇［13，15］、荞 麦碱［16］等的研究，而有关苦荞中皂苷的研究报道却极少，如黄海燕［17］研究表明苦荞中含有的皂苷类成分具有降血糖作用。

本试验以苦荞籽粒为原料，采用热回流提取方法，研究提取过程中提取液体积分数、液固比、提取时间、提取温度对提取得率的影响，通过SAS及响应曲面分析方法优化苦荞总皂苷提取工艺。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苦荞（黑丰一号）：山西农科院，于60℃真空干燥至恒重，粉碎后过60目筛保存备用。

1.2 主要试剂与仪器

薯蓣皂苷标准品（＞95%）：百灵威科技有限公司；香草醛（99.0%）：北京化学试剂公司。

UNIC2100紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：上海知信技术有限公司；FW100粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 提取工艺流程

苦荞籽粒→粉碎→过60目筛→50℃索氏脱脂→干燥→脱脂苦荞粉末→乙醇热回流提取→离心、浓缩提取液→石油醚萃取脱脂→饱和正丁醇萃取→浓缩干燥→苦荞总皂苷粗品

1.3.2 苦荞皂苷含量的测定方法

1.3.2.1 标准溶液的配制

称取香草醛2.5 g，用冰醋酸溶解并定容至50 mL得5%的香草醛-冰醋酸溶液。

称取干燥至恒重的薯蓣皂苷对照品10 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，摇匀，即得0.4 mg／mL的薯蓣皂苷标准溶液。

1.3.2.2 标准曲线的制作

量取0.4 mg／mL的薯蓣皂苷标准品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL于 25 mL具塞试管中，于70℃水浴上蒸干甲醇后取出，依次加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，于70℃水浴上封口加热15 min，迅速在冰水中冷却，再加入5 mL的冰醋酸摇匀，以香草醛 -冰醋酸溶液∶高氯酸∶冰醋酸＝1∶4∶25的混合溶液作为空白对照，于最大吸收波长454 nm处测得吸光值（A）。以吸光值A为纵坐标，薯蓣皂苷标准品质量含量为横坐标作标准曲线。

通过线性拟合得标准曲线方程：m＝5.822 9A+0.034，R2＝0.998 9，式中：m为苦荞总皂苷的质量／mg。苦荞总皂苷含量在0.04～0.30 mg范围内与吸光值线性关系良好。

1.3.3 样品处理

将苦荞籽粒脱壳粉碎后过60目筛，以石油醚（30～60℃）于50℃索氏提取8 h，干燥至恒重得脱脂苦荞粉末。称取一定量的脱脂原料，按照设定液固比加入一定量乙醇水溶液，混匀，置于磁力搅拌器上保持恒定的转速进行热回流提取后离心除去残渣，浓缩提取液，浓缩后的提取液用蒸馏水溶解后加石油醚等体积萃取3次脱脂，取下层水相加水饱和正丁醇等体积萃取3次，合并正丁醇相，浓缩并干燥，得到苦荞总皂苷粗品。

将苦荞总皂苷粗品用甲醇溶解并定容，分别吸取100、200、300μL的样液，以1.3.2中的步骤处理后，测定吸光值A，根据标准曲线分别计算样苦荞提取液中总皂苷的含量，取平均值。

苦荞皂苷得率：

2 试验设计

2.1 单因素试验设计

通过预试验，确定以乙醇水溶液浓度（V／V）、液固比（V∶W）、提取时间和提取温度进行单因素试验。

2.2 优化试验

在单因素试验的基础上，综合考虑4个因素对提取物中皂苷得率的影响，并以Box-Behnken中心组合试验设计优化工艺，见表1。

表1 自变量及因素编码水平

2.3 数据分析

单因素试验数据使用Excel软件；Box-Behnken中心组合试验设计采用Design expert 7.0与SAS9.2软件进行分析。

3 结果与分析

3.1 乙醇浓度对苦荞皂苷得率的影响

分别称取脱脂后苦荞粉10 g，分别加入30%、50%、70%、80%、90%的乙醇水溶液，置于三口烧瓶中，以12∶1的液固比，于50℃提取60 min，按照1.3.3处理并测定皂苷得率，以考察乙醇水溶液体积浓度的变化对苦荞皂苷得率的影响，结果如图1。

图1 不同乙醇浓度对苦荞皂苷得率的影响

从图1可看出，随着乙醇浓度的提高，苦荞皂苷的得率呈现先上升后下降的趋势。乙醇体积分数约为75%时，皂苷得率达到最大值。可能是因为乙醇浓度的增加导致溶剂的沸点降低，使得回流更容易实现，相同提取时间内回流效率更高，物料与提取液接触更充分，提高了提取量［18］。而当乙醇浓度超过75%时，色素、醇溶性杂质以及亲脂性强的成分溶出量增加［19］，使溶液黏度变大，传质过程中溶剂的阻力增大，减缓了皂苷类成分向主体溶剂的扩散过程，物料粉末表面与溶剂之间的浓度差下降，导致皂苷提取得率下降。

3.2 液固比对苦荞皂苷得率的影响

分别称取脱脂后苦荞粉 10 g，分别以 6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、15∶1的液固比，加入70%的乙醇水溶液，置于三口烧瓶中，于50℃水浴提取 60 min，按照1.3.3中的步骤处理后测定皂苷含量，考察液固比的变化对苦荞皂苷得率的影响，结果见图2。

图2 不同液固比对苦荞皂苷得率的影响

从图2可看出，苦荞皂苷的得率随着液固比的增大而提高，液固比为6∶1～12∶1范围内时，皂苷得率迅速提高，之后趋于平缓。其原因是溶剂用量少，提取不完全，在一定范围内，溶剂用量增加，溶剂和苦荞粉末之间的接触面变大，有助于苦荞皂苷类化合物的浸出，但溶剂用量过大会导致水浴加热负荷大，提取完全需要时间长，从减少溶剂用量和降低浓缩、提纯负荷，节约成本等方面综合考虑，采用12 mL／g的液固比。

3.3 提取时间对皂苷得率的影响

分别称取脱脂后苦荞粉10 g，置于三口烧瓶中，用70%的乙醇，以12∶1的液固比，于50℃水浴上分别回流提取30、60、90、120 min，按照1.3.3中的步骤处理后测定皂苷含量，考察提取时间的变化对苦荞皂苷得率的影响，结果见图3。

由图3可知，随着提取时间的延长，苦荞皂苷提取得率呈现先增加后降低的趋势。可能的原因是增加提取时间，可以使反应进行得较完全，苦荞中的皂苷类成分不断地溶出、进入溶液，提取得率上升。但提取一定时间后，皂苷类化合物已基本溶出，继续延长提取时间，反而使得一些水溶性、醇溶性强的杂质类成分溶出量增加导致得率下降，表明过长时间的提取无法增加苦荞皂苷的得率，反而还会增加能耗，因此应控制提取时间60 min左右为宜。

图3 不同提取时间对苦荞皂苷得率的影响

3.4 提取温度对皂苷得率的影响

分别称取脱脂后苦荞粉10 g，置于三口烧瓶中，用70%的乙醇，以12∶1的料液比，设定提取温度分别为 30、40、50、60、70℃，回流提取 60 min，按照1.3.3处理并测定皂苷含量，考察提取温度的变化对苦荞皂苷得率的影响，结果见图4。

图4 不同提取温度对苦荞皂苷得率的影响

由图4可知，提取温度在低于50℃时，随温度的升高皂苷提取率明显增加，但超过50℃提取率反而随温度升高而降低。可能是因为温度越高提取溶剂沸腾的越快，回流效率越高，但过高的提取温度下杂质的溶出量也会增加，导致得率降低。

3.5 拟合模型的建立及方差分析

依据表1 Box-Behnken中心组合试验设计方案进行试验，并将试验结果按式（1）计算，得出不同试验条件下所提取样品中的皂苷得率，如表2。

对表2试验数据利用SAS RSREG Procedure进行回归分析，得到影响苦荞皂苷回流提取效果的4个因素与响应值的标准四元二次回归方程：

上述拟合回归模型的方差分析、参数估计及显著性检验结果见表3。

由表3分析结果可知，P＜0.000 1，表明模型极其显著。逐项显著性检验（t检验）结果表明：一次项x1、x3、x4对试验结果的影响显著（P＜0.1），二次项、交互项（x1x4除外）对试验结果有高度显著的影响（P＜0.001），表明各因素对苦荞皂苷提取得率的影响不是简单的线性关系。残差项各项数据分析表明该模型失拟不显著（P＝0.872 1＞0.1），模型的决定系数R2＝0.983 2，远大于R2＞0.8的建议标准，极其显著且具有解释变异98.32%的能力，即98.32%的试验数据可用这个方程解释，表明该二次方程能够较好地拟合真实的响应面，试验误差小，可以用此模型对苦荞总皂苷提取工艺进行分析和预测。

表2 中心组合试验设计与结果

表3 二次响应面回归模型方差分析及参数估计

表3 （续）

3.6 回归方程的优化

剔除式（2）中的不显著项（P＞0.25），利用 SAS GLM Procedure逐步回归，简化后的回归方程为：

表4 优化后回归模型方差分析及参数估计

拟合回归模型的方差分析、参数估计及显著性检验结果见表4。结果表明，模型各项检测数据均达到理想指标，拟合程度良好，R2＝0.9828。

3.7 模型的分析与讨论

3.7.1 主因子效应及其边际效应分析

对拟合模型进行降维后求导，得到4个因子在不同水平下对苦荞总皂苷得率影响关系的边际效应，如图5所示。乙醇浓度、液固比、提取温度和提取时间的因子性状的边际效应指数与苦荞皂苷得率边际效应指数呈显著负相关；乙醇浓度、液固比、提取温度、提取时间4因子对应线性方程的决定系数（即斜率）分别为 -7.432、-2.802、-2.7446、-1.6746。由边际效应图可以看出，随着乙醇浓度的变化，苦荞皂苷得率的变化速率最快，料液比和提取温度次之，提取时间变化速率最慢。

图5 各因子边际效应指数

3.7.2 交互效应分析

由回归方程的回归系数显著性检验结果可知，各因素间存在显著的交互效应。对回归方程采用降维分析方法，将4个因子中任意2个固定在零水平，考虑其余2个因子对提取得率的影响。

根据回归方程作出两因子交互作用的响应曲面和等高线，以乙醇浓度和提取时间、液固比和提取温度、提取温度和提取时间的交互作用（图6～图8）为例进行分析。如果一个响应曲面坡度相对平缓，表明处理条件件的变化对皂苷得率的影响较小；相反如果一个响应曲面坡度非常的陡峭，表明响应值对于处理条件的改变非常敏感。分析可知：图6表明在一定的液固比和提取温度条件下，乙醇浓度对皂苷得率的影响明显大于提取时间；图7表明在一定的乙醇浓度和提取时间条件下，液固比和提取温度对得率的贡献率相当；图8表明在一定的乙醇浓度和液固比条件下，提取时间和提取温度对得率的影响亦相当，均可显著改变皂苷提取得率。

图6 乙醇浓度和提取时间对苦荞皂苷得率的交互效应

图7 提取温度和液固比对苦荞皂苷得率的交互效应

图8 提取时间和提取温度对苦荞皂苷得率的交互效应

3.8 最佳工艺参数优化

采用SAS软件和design expert软件对试验数据进行优化后，得到的最优工艺条件为：乙醇体积分数69.51%，液固比为12.37 mL／g，提取温度50.7℃，提取时间63.24 min，总皂苷得率最大值为22.82 mg／g。在上述优化的工艺条件下，经过3次重复验证试验，苦荞皂苷平均得率达（22.54±0.31）mg／g。

4 结论

4.1 通过单因素试验和Box-Behnken试验设计建立了回流提取苦荞皂苷的优化回归数学模型，该模型在本试验条件范围内能较为准确的预测苦荞皂苷提取得率。通过方差分析及边际效应分析可知，各因素对苦荞皂苷提取率的影响由大到小依次为：乙醇浓度＞提取温度＞提取时间＞液固比，同时受乙醇浓度变化的影响，苦荞皂苷得率变化速率最快，料液比和提取温度影响皂苷得率的变化速率次之，提取时间变化速率最慢。

4.2 优化后最优工艺条件为：乙醇体积分数69.51%，液固比为12.37mL／g，提取温度50.7℃，提取时间63.24min，总皂苷得率最大值为22.82 mg／g。同一条件下进行验证试验，实际测得的平均得率为（22.54±0.31）mg／g（n＝3），试验数据稳定，表明采用响应面法优化得到的回流浸提工艺参数较为准确、可靠，具有一定的参考价值。

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Technology Optimization for Extracting Total Saponin from Tartary Buckwheat

Zhi Xiujuan1，2Li Dong1Cao Xinjie2Ding Ke2Ma Tingjun2
（College of Engineering of China Agriculture University1，Beijing 100083）
（Faculty of Food Science and Engineering，Beijing University of Agriculture Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue Beijing Laboratory of Food Quality and Safety2，Beijing 102206）

To ascertain the optimal extraction condition of total saponins from tartary buckwheatwith thermal reflux method，the study which using the response surface design，was conducted to investigate the influence of different extraction temperature，extraction time，liquid-solid ratio，ethanol volume concentration and their cross-actions on saponin yield.Based on the SAS and design expert analysis，the optimum extraction conditionswere alcohol concentration of 69.51%，liquid-solid ratio of 12.37 mL／g，extraction temperature of 50.7℃，extraction time of 63.24 min.Under the optimized extraction conditions，it can be included that the saponin yield was（22.54±0.31）mg／g，and the experimental data was stable，which was close to the estimated value 22.82 mg／g attained by using regression model.Thismodel could be used to predict the experiment resultswell.

tartary buckwheat，saponin，reflux extraction，response surfacemethod

R284.2；TS201.1

A

1003-0174（2015）07-0097-07

时间：2015-05-05 06：48

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／11.2864.TS.20150505.0648.006.html

国家燕麦荞麦产业体系建设专项（CARS-08-D-2），北京农学院青年科学基金（1086716093）

2014-07-12

智秀娟，女，1975年出生，讲师，农产品加工与贮藏

马挺军，男，1973年出生，教授，农产品加工