粮油作物中伏马菌素B1免疫测定方法的建立

胡骁飞 王方雨 邢广旭 杨继飞 张改平，2 邓瑞广

（河南省农业科学院动物免疫学重点实验室1，郑州 450002）

（河南农业大学2，郑州 450002）

粮油作物中伏马菌素B1免疫测定方法的建立

胡骁飞1王方雨1邢广旭1杨继飞1张改平1，2邓瑞广1

（河南省农业科学院动物免疫学重点实验室1，郑州 450002）

（河南农业大学2，郑州 450002）

旨在制备伏马菌素B1单克隆抗体，并建立伏马菌素B1免疫学检测方法。以制备的免疫原FB1-BSA免疫小鼠，利用细胞融合技术建立能分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株，体内诱生腹水的方法制备FB1单抗。基于制备的FB1单抗，建立间接竞争ELISA检测分析方法，并对检测方法性能进行了初步鉴定。结果表明，通过动物免疫、细胞融合筛选到1株分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株3F6。建立的间接竞争ELISA检测分析方法检测范围40～600 ng／mL之间，检测下限达到40 ng／mL，半数抑制浓度 IC50为136.81 ng／mL，除与FB1特异性反应外，与同系物FB2及FB3交叉反应率分别为11.65%和7.85%，与黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、β-玉米赤霉烯醇、呕吐毒素、T-2毒素、玉米赤酶烯酮、赭曲霉毒素A、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇交叉反应率均低于0.2%，样品回收率在88.89%到115.45%之间，平均101.91%，变异系数为7.43%。本研究建立的ELISA方法与LC-MS-MS检测相同的样品时，二者的检测结果没有显著差异（P＞0.05）。本研究初步研发出灵敏度符合检测要求、特异较强、准确度较高、简便快捷的FB1免疫学检测方法。

粮油作物 伏马菌素B1细胞融合 单克隆抗体 免疫检测

粮油作物在生长、收获或保存期间容易受霉菌侵染，引起农作物霉变，产生霉菌毒素，伏马菌素就是其中的一种。伏马菌素（Fumonisin）又称为烟曲霉毒素，是一类由霉菌串珠镰刀菌、多育镰孢等产生的代谢产物，玉米和大豆是最容易受伏马菌素污染的粮油作物，其他作物如小麦、大麦、花生、棉花、水稻等也比较容易被伏马菌素污染［1］。伏马菌素种类较多，包括 A1、A2、B1、B2、B3、B4、C1、C2等，但自然界中只有伏马菌素 B1、B2、B3被检测到过［2］。其中，伏马菌素B1（FB1）最为常见，约占60%以上，毒性最强，危害也最大［2］。

我国的粮食并不富足，粮食自给率只有90%，而且我国由于粮油作物产品保存不合理，导致霉菌毒素污染造成巨大的粮食浪费，直接或间接损失达到数百亿元［2］。采食含有霉菌的粮食对人及动物危害巨大，阻碍人及动物的生长，降低机体免疫力，增加人及动物的死亡率［1，3］；导致马属动物脑白质软化症［4-5］；诱发猪的肺水肿病变，胸膜积水，肝损伤［6-8］；抑制人类神经酰胺合成和神经鞘磷脂代谢，降低致炎性细胞因子表达合成［3］；导致肾癌和食管癌［3］。

尽管目前有多种灵敏度高、结果准确可靠的伏马菌素检测方法，如薄层层析（Thin Layer Chromatography，TLC）法［9］；毛细血管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）法［10］；高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）法［11-12］；电喷雾质谱（Electrospraymass spectrometry）法［13］；多重实时定量 PCR（Multiplex real-time PCR）法［14-15］；反相高效液相色谱（Reversed-phase HPLC／电喷雾飞行时间离子阱质谱）法［16］；以及液相色谱衍生的高效液相色谱结合电雾式检测器法［17］和液相色谱结合荧光测定法［18］；但这些方法适合在大型实验室或科研单位使用，并不能在广大的粮食生产加工、饲料生产加工企业及养殖企业内普及使用，因此不易对粮食或饲料进行广泛的预警性监控检测。为了更好地监控粮食或饲料的霉菌污染情况，保证我国粮油食品质量安全，维护人及动物健康，降低因霉菌污染造成的损失，有必要建立一种简单、快捷、成本低廉、易于普及的霉菌毒素检测方法。

免疫学检测技术是利用抗原抗体特异性反应原理建立起来的检测技术，它具有灵敏度高、特异性强、简便、快捷、费用低廉等优点。本研究拟制备出伏马菌素B1特异性单克隆抗体，并基于制备的单抗建立检测粮油作物中伏马菌素B1的免疫学方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

FB1-BSA、FB1-OVA：自备；BALB／C小鼠：郑州大学，本实验室繁养；FB1、FB2、FB3、T-2毒素、黄曲霉素素B1、黄曲霉素素M1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、β-玉米赤霉烯醇、呕吐毒素、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇标准品：FERMENTEK公司；弗氏完全佐剂（FCA）、弗氏不完全佐剂（FIA）：Sigma公司；山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记二抗（GaMIgGHRP）、1640培养基、HAT选择性培养基、HT：Gibco公司；PEG4 000（聚乙二醇）：Pierce公司；强阴离子交换固相萃取柱（500 mg，3 mL）：美国沃特世公司；其他试剂：市售，均为AR级。

iMark酶标仪：美国伯乐公司；EBA21离心机：德国Hettich公司；酶标板自动洗涤机：美国伯腾公司；超高效液相色谱仪（UPLC）、Xevo TQ质谱仪（MS）：美国沃特世公司。

1.2 方法

1.2.1 动物免疫

取6～8周龄 BALB／C母鼠6只，用FB1-BSA进行免疫，免疫剂量10μg免疫原蛋白／200μL只，背部皮下分4点注射。首次免疫时，用无菌PBS稀释FB1-BSA到目标剂量的2倍，然后与等量FCA混合，完全乳化；之后3次免疫，步骤同首次免疫，FCA替换为FIA，2次免疫间隔4周左右。

1.2.2 血清测定及融合小鼠筛选

第4次免疫10 d后，尾静脉采血，PBS稀释200倍，2 000×g离心10 min，分离血清。间接ELISA测定血清效价［19］，并做少许修改，包板用 FB1-OVA；阳性孔判定条件为待测孔OD450值≥0.2，同时满足待测孔 OD450：阴性孔 OD450≥2.1（P／N≥2.1）。

间接竞争ELISA测定血清抑制效价，测定过程及计算步骤见参考文献［19］，并做了细微修改，用FB1-OVA包板，使用的标准品是FB1。

根据测定的血清效价和抑制效价，筛选效价高，抑制效价好的小鼠作为细胞融合备用小鼠。

1.2.3 超强免疫

用PBS稀释FB1-BSA到250μg／mL，取200μL对筛选的融合备用小鼠进行超强免疫，免疫剂量为50μg／（200μL／只），不需要免疫佐剂及乳化，直接尾静脉和腹腔各注射100μL。

1.2.4 细胞融合

用于融合的小鼠超强免疫4 d后，摘眼球放血，分离液制备阳性血清，-20℃冷冻备用。然后，将小鼠抻颈致死，75%酒精浸泡5 min左右。无菌取小鼠脾脏进行细胞融合［20］。1只小鼠脾脏融合后，均匀铺在5块96孔培养板上。

1.2.5 杂交瘤筛选

待融合细胞生长至覆盖培养孔1／3孔底面积时，将细胞板各孔细胞上清取出一部分，2倍稀释，间接ELISA测定上清效价，选取OD450值在1.0以上的孔，阻断ELISA测定抑制效价。最终选效价高、抑制率好、细胞生长旺盛的孔转入24孔培养板中扩大培养后进行2次有限稀释克隆化，然后扩大培养、建株、反复冻存与复苏，最后筛选到能稳定分泌抗FB1单克隆抗体的细胞株。

1.2.6 FB1单抗制备及纯化

利用体内诱生腹水的方法制备FB1单克隆抗体（FB1mAb），辛酸包好硫酸铵盐析法纯化抗体［20］。采用考马斯亮蓝法测定了抗体蛋白含量。

1.2.7 FB1免疫学检测试剂盒建立及性能测定

1.2.7.1 FB1单抗和GaMIgG-HRP的工作浓度确定

基于制备的FB1单抗，取4μg／mL包被原包被的8×8孔酶标板，FB1单抗用PBS稀释，从4 000倍倍比至512 000倍，GaMIgG-HRP原液用5%猪血清稀释，从125倍倍比至16 000倍，采用棋盘法确定FB1单抗和GaMIgG-HRP的工作浓度。确定的原则是不同单抗浓度与GaMIgG-HRP浓度交叉点OD值接近于1时，该点就是GaMIgG-HRP工作浓度，而该点前面一个单抗浓度为最佳单抗工作浓度，从而建立FB1免疫学检测试剂盒［21］。

1.2.7.2 标准曲线建立

分别配制 0、10、20、40、60、80、100、150、200、250、300、400、600、800、1 000、1 500、2 000 ng／mL的FB1标准溶液，阻断ELISA测定不同浓度FB1标准品的OD450值，每个浓度的OD450值共重复2次。计算FB1mAb对不同浓度FB1标准品的抑制率，以FB1浓度／10的对数值为横坐标，各浓度FB1对应的OD450值B与0 ng／mL FB1浓度对应的OD450值B0的百分比（B／B0%）为纵坐标，初步建立制标准曲线。根据上述的标准曲线，重新取检测点确定检测的线性范围，并重新建立线性范围的标准曲线。

1.2.7.3 测定步骤

在包被有抗原的酶标板中加入标准样品或检测样品50μL，然后加入工作浓度的FB1单克隆抗体50 μL，37℃孵育25 min，PBST洗涤6次，甩净拍干；每孔加入工作浓度的GaMIgG-HRP 50μL，37℃孵育25 min，PBST洗涤6次，甩净拍干；每孔加入显色液50μL，室温显色 5 min，加入终止液50μL，上机读值。

1.2.7.4 检测灵敏度确定

根据线性范围标准曲线公式，计算检测方法灵敏度（即半数抑制浓度，IC50值）。

1.2.7.5 检测限鉴定

根据线性范围标准曲线公式检测20个0 ng／mL（即不含标准品的空白样），按文献描述的方法计算检测限［22］。

1.2.7.6 特异性鉴定

免疫学检测方法特异性鉴定就是计算交叉反应率，具体步骤如文献描述，并稍微改动［20］，选用的抑制剂除FB1外，还包括FB2、FB3、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素 M1、黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇、T-2毒素。

交叉反应率／%＝FB1IC50／竞争物IC50×100

1.2.7.7 准确性鉴定

用建立的检测方法，测定含FB1200 ng／mL标准溶液20次，计算测定值、回收率及变异系数（Coefficient of Variation CV）。

1.2.7.8 液相色谱-串联质谱法（LC-MS-MS）确证

由河南省农科院农业质量标准与检测技术研究中心提供2个霉变玉米样品，粉碎后经过处理，分别利用LC-MS-MS及本研究建立的免疫学检测方法进行测定。每个玉米样品6个重复。

1.2.8 样品处理

用LC-MS-MS测定时，玉米样品粉碎后，称取2 g于50 mL离心管中，加入10 mL 75%甲醇溶液，涡旋 1 min，超声提取5 min，以5 000 r／min离心 2 min，取上清。用0.2 mol／L的氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH至5.8～6.5。然后量取2 mL至固相萃取小柱中。依次用3 mL75%甲醇溶液，3 mL甲醇淋洗小柱，抽至近干后用10 mL 1%的乙酸甲醇溶液（10 mL乙酸于1 L容量瓶中用甲醇定容）洗脱。萃取过程流速控制在1～2 mL／min。洗脱液于50℃氮气吹干，残留物用1 mL 75%甲醇溶液溶解，过0.22μm滤膜后，用液相色谱-串联质谱测定分析。

用本研究建立的ELISA方法测定时，玉米样品粉碎过60目筛，称取1 g，加入双蒸水10 mL，涡旋器涡旋振荡混匀后静置5 min，取上清，双蒸水稀释2.5倍测定。

1.3 数据处理及统计分析

检测玉米样品时，检测结果表示为平均数±标准误（mean±SE），采用SPSS13.0软件进行单因素独立T检验分析，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 血清效价及抑制效价

由表1可以看出，第4次免疫10 d后，1、2、5号小鼠的效价达到1∶6 400，3、4号小鼠效价为1∶3 200，6号小鼠效价最低，为1∶1 600，说明制备的免疫原比较成功。从表2可以看出6只老鼠血清均有抑制效价，其中3号小鼠的抑制效价最好（见图1），其IC50为808 ng／mL。由于3号小鼠的效价相对比较高，且抑制效价比较好，所以选为融合备用小鼠。

图1 3号小鼠抑制效价

表1 第4次免疫后小鼠血清效价

表2 第4次免疫后小鼠血清抑制效价

2.2 杂交瘤细胞株筛选

细胞融合后，经过2次亚克隆，共获得2株杂交瘤细胞株，通过测定获得最终得到一株能分泌高效价、高灵敏度、强特异的抗FB1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经过反复冻融复苏，细胞稳定性比较好，命名为3F6。

2.3 FB1单抗纯化

体内诱生的腹水采用辛酸包好硫酸铵盐析法进行了纯化，并利用考马斯亮蓝法测定了抗体蛋白浓度（6个平行样本）。由图2可以看出，与未纯化FB1腹水凝胶电泳后，有多条蛋白条带，二纯化后只有2条蛋白条带，分别在50 ku和25 ku左右，与抗体的重、轻链分子量大小基本一致，其他条带均消失，说明辛酸包好硫酸铵盐析法纯化腹水效果比较好。由表3可知，纯化后腹水中FB1单克隆抗体蛋白浓度约为 8.947 mg／mL。

表3 纯化的腹水单抗蛋白浓度

图2 腹水纯化后SDS-PAGE图

2.4 FB1单抗和GaMIgG-HRP的工作浓度确定

由表4可以看出，当GaMIgG-HRP为2 000倍稀释，FB1单抗稀释64 000倍时，或当GaMIgG-HRP为4 000倍稀释，FB1单抗稀释32 000倍时或当GaMIgG-HRP为500倍稀释，FB1单抗稀释128 000倍时对应的交叉点读值均接近于1，根据节约抗体的原则，同时避免由于二抗浓度过高影响检测结果，则选取GaMIgG-HRP为2 000倍稀释与FB1单抗稀释64 000倍稀释交叉点。因此，最终确定的GaMIgGHRP工作浓度为2 000倍稀释，而单抗工作浓度为64 000倍稀释。

表4 棋盘试验结果

2.5 标准曲线建立

由图 3a可以看出，由 0、10、20、40、60、80、100、150、200、250、300、400、600、800、1 000、1 500、2 000 ng／mL的 FB1标准溶液，阻断 ELISA测定 OD值建立的曲线更接近一个反S型曲线，而按直线方程计算时其方程为 Y＝-47．129X+103．44，R2＝0.958 5。而由图 3b可以看出，由 0、40、60、80、100、150、200、250、300、400、600 ng／mL的 FB1标准溶液建立的曲线则接近直线，线性方程为Y＝-64．061X+122．78，R2＝0.993 6。因此，确定图3b为线性标准曲线，线性范围为40～600 ng／mL。根据线性方程Y＝-64．061X+122.78，计算出所建立的检测方法灵敏度，即 IC50＝136.81 ng／mL。

用该检测方法检测20个0 ng／mL FB1标准品，所得平均值为1.033 3，标准差SD＝0.079 6，计算出最低检测限时的OD值比，LOD%＝（1.033 3-2×0.079 6）×100／1.03 33＝84.589%，代入标准曲线方程，最终计算出最低检测限 LOD为39.461 ng／mL，考虑实际操作过程中存在误差，因此检测限确定为 40 ng／mL。

2.6 测定方法的特异性

由表5可以看出，本研究中所建立的FB1免疫学检测方法除与FB1反应外，与同系物FB2及FB3交叉反应率分别为11.65%和7.85%，与其他类毒素交叉反应率均小于0.2%，因此认为无交叉反应。

图3 标准曲线

表5 测定方法特异性（交叉反应率）

2.7 测定方法的准确性

一种测定方法准确性通常主要以样品回收率及测定结果的变异系数表示。从表6结果可以看出，测定200 ng／mL FB1的标准溶液20次，测定值在177.77 ng／mL到230.9 ng／mL之间，平均203.81 ng／mL；回收率在88.89%～115.45%之间，平均101.91%，变异系数CV为7.43%，表明建立的FB1检测方法准确度比较高。

表6 测定方法的准确性

2.8 与LC-MS-MS测定结果比较

利用本研究所建立FB1的ELISA测定方法与LC-MS-MS同时测定2个霉变的玉米样品，测定结果见表7。由表7可以看出，尽管2种测定方法的数值有些微的差异，但差异并不显著（P＞0.05），说明本研究建立的FB1的ELISA测定方法结果准确可靠。

表7 所建立的检测方法与LC-MS-MS测定结果比较

3 讨论

3.1 FB1杂交瘤筛选及单克隆抗体的制备

免疫学检测技术利用抗原抗体特异性反应原理建立起来的检测技术，具有特异灵敏等特点。快速简便的特性，使其在各个行业中得以广泛应用。免疫学检测方法的建立是基于良好的抗体制备。本研究中用FB1制备的完全抗原FB1-BSA免疫小鼠，并通过杂交瘤技术将分泌抗FB1抗体的小鼠脾脏细胞与NS0瘤细胞进行融合，经过2次有限稀释法克隆，筛选出1株能特异分泌抗FB1单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。利用体内诱生腹水的方法批量制备腹水［23］并进行有效的腹水纯化，为FB1免疫学检测方法建立奠定了基础。

3.2 FB1免疫学检测方法的建立及初步性能测定

根据抗原抗体免疫反应原理，采用间接竞争ELISA模式。在酶标板孔中包被固定包被原FB1-OVA，加入FB1标准品溶液及工作浓度的FB1单抗。溶液中FB1标准品和包被在酶标板上的FB1与溶液中FB1单抗竞争性结合，通过洗涤作用，溶液中多余的FB1标准品、FB1标准品与FB1单抗结合物被洗脱。加入工作浓度的酶标二抗后，其与吸附在酶标板上FB1单抗结合，通过洗涤作用，洗脱多余的酶标二抗。利用酶的底物进行显色，而根据显色情况达到对样品FB1含量进行测定。本研究中通过棋盘试验确定了FB1单克隆抗体及酶标二抗GaMIgG-HRP的工作浓度，单抗工作浓度为1∶320 000倍稀释，酶标二抗工作浓度为1∶2 000倍稀释，从而建立了灵敏度高，特异性强的FB1免疫学测定方法。

本研究对建立的FB1免疫测定方法进行了初步性能鉴定，其检测范围在40～600 ng／mL之间，检测下限达到 40 ng／mL，灵敏度 IC50为 136.81 ng／mL。我国目前还没有有关粮食、饲料中伏马菌素B1含量限制要求，美国食品中要求 FB1含量不能超过1 000 ng／mL，因此，尽管本研究建立的FB1免疫学检测产品比个别市售相同产品的灵敏度低一些，但完全能够满足检测需求。而且研究认为，免疫检测技术的灵敏性越高，则检测过程中出现假阳性的几率越大［24］。本研究建立的FB1免疫学检测方法除了与其同系物FB2、FB3有一些交叉外，与其他类霉菌毒素交叉反应率均低于0.2%，说明检测方法特异性比较好。研究认为检测过程中样品回收率变异系数不高于15%即为准确度比较高［25］，本研究建立的检测方法样品回收率平均为101.91%，变异系数为7.43%说明建立的检测方法准确度高。FB1的LCMS-MS测定方法是我国农业行业标准方法（NY／T 1970—2010）［26］，本研究建立的免疫学 ELISA检测方法与LC-MS-MS检测方法同时检测样品时，二者的检测结果没有显著差异，说明本研究建立的免疫学ELISA检测方法检测结果准确可靠。

4 结论

利用制备的免疫原FB1-BSA免疫小鼠，通过细胞融合技术筛选出能分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株，体内诱生腹水法制备腹水。基于制备的FB1单抗，初步建立了特异性强，灵敏度高的伏马菌素B1免疫学检测方法。本方法的建立有利于加强对粮食作物中霉菌毒素的监控检测，有利于预防粮食作物霉变的预警机制的建立，为我国粮食安全提供技术保障。

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［26］NY／T 1970—2010，饲料中伏马毒素的测定［S］.

Establishment of Immunoassay Methods to Detect Fumonisin B1in Grain and Oil Crops

Hu Xiaofei1Wang Fangyu1Xing Guangxu1Yang Jifei1Zhang Gaiping12Deng Ruiguang1

（Key Lab for animal immunology，Henan Academy of Agricultural Science1，Zhengzhou 450002）
（Henan Agricultural University2，Zhengzhou 450002）

The study was aimed at preparation ofmonoclonal antibodies of fumonisin B1（FB1）and establishing of immunoassaymethods.The mice were immunized by immunogen FB1-BSA，and hybridoma cell line secreting monoclonal antibody against FB1（FB1mAb）was prepared by cell fusion technology，while FB1monoclonal antibody was prepared by in vivo induction.The indirectly competitive ELISA was established by the prepared FB1mAb，with a preliminary evaluation.The results showed that one hybridoma cell line 3F6 could be obtained by animal immunizing and cell fusion.The indirectly competitive ELISA had a detection range between 40 ng／mL and 600 ng／mL，and the detection limitwas40 ng／mL；50%inhibitory concentration（IC50）was136.81 ng／mL.Themethod has specific reaction with FB1，the cross-reactivity ratio with FB2，FB3and the ratio with other mycotoxins（aflatoxin B1，aflatoxin M1，β-zearalenol，deoxynivalenol，T-2 toxin，zearalenone，ochratoxin A，zearalanone，zeranol）were 11.65%，7.85%and less than 0.2%respectively.The recovery ranged from 88.89%to 115.45%，for an average as 101.91%；and the CV was 7.43%.The same samples were assayed by LC-MS-MS and ELISA.There were no significant difference between the twomethods（P＞0.05）.In a conclusion，the sensitivity，specificity，accuracy，simple and efficient FB1immunological detection method was developed.

grain and oil crops，fumonisin B1，cell fusion，monoclonal antibody，immunoassay

S56文献标示码A

1003-0174（2015）07-0116-07

公益性行业（农业）科研专项（201203040），河南省农业科学院优秀青年科技基金（2013YQ29）

2014-02-21

胡骁飞，男，1972年出生，副研究员，食品、饲料安全快速检测技术

邓瑞广，男，1960年出生，研究员，动物重大疫病快速监测技术和食品安全快速检测技术