2-(N-芳基氨甲基)苯并异噻唑啉酮类化合物对海洋浮游生物的生长抑制活性研究

刘冬东，施佳乐，胡 玥，王爱明，王向辉，林 强，杨建新*

(1. 海南大学 材料与化工学院，海南 海口 570228；2.热带生物资源教育部重点实验室，海南 海口 570228；3.海南省精细化工工程技术研究中心，海南 海口 570228；4.海南师范大学 化学与化工学院, 海南 海口571158)

2-(N-芳基氨甲基)苯并异噻唑啉酮类化合物对海洋浮游生物的生长抑制活性研究

刘冬东1,2,3，施佳乐1,2,3，胡 玥1,2,3，王爱明1,2,3，王向辉4，林 强4，杨建新*1,2,3

(1. 海南大学 材料与化工学院，海南 海口 570228；2.热带生物资源教育部重点实验室，海南 海口 570228；3.海南省精细化工工程技术研究中心，海南 海口 570228；4.海南师范大学 化学与化工学院, 海南 海口571158)

本文研究了13个2-(N-芳基氨甲基)苯并异噻唑啉-3-酮类化合物对球等鞭金藻Isochrysisgalbana、亚心形扁藻Platymonassubcordiformis及舟形藻Navicula的生长抑制性能，并测试了其对藤壶二期无节幼虫的生物活性。结果表明：2-(N-芳基氨甲基)苯并异噻唑啉-3-酮类化合物对球等鞭金藻、亚心形扁藻和舟形藻都有良好的生长抑制活性，其中对球等鞭金藻和亚心形扁藻的抑制作用较强；对藤壶幼虫的生物活性测试表明，化合物最低质量浓度为2.0 mg/L时，除化合物g和l，都具有良好的生长抑制活性。化合物的结构与浮游生物的生长抑制活性关系表现为间位取代优于对位取代。

苯并异噻唑啉酮；藻类；藤壶；生物活性

0 引言

海洋污损生物是生长在海中船底和其他人工设施表面的动物、植物和微生物的总称，海中设施因长生物而造成的危害称生物污损[1]。污损生物吸附在船底，会增加船底表面的粗糙度、增加船舶航行的阻力、降低航速，增加燃油消耗，腐蚀船底，破坏船体；附着在金属表面，可导致涂层破损，使金属裸露，加快腐蚀；附着在海底管道的内表，可使管径缩小，甚至堵塞管道，因此,海洋污损是迫切需要解决的重要研究方向之一[2-4]。目前，全世界每年由生物污损造成的损失已经严重影响了人们对海洋资源的进一步开发和利用[5]。

涂覆防污涂料是目前常用的理想和方便的防除海洋生物污损的方法之一。早期传统型的防污涂料主要以有机锡和氧化亚铜为主要成分，但随后的研究发现这类防污剂在防除污损生物的同时，也引起了环境污染问题[6-7]。本文所研究的异噻唑啉酮类化合物是一类高效、低毒的新型广谱杀菌剂，它具有对环境安全等优点，被用于新型海洋防污剂的开发，目前也已经有商品化的该类防污剂[8-10]。

本文以实验室合成的13种2-(N-芳基氨甲基)苯并异噻唑啉-3-酮类化合物[11]为活性物质，测试其对球等鞭金藻Isochrysisgalbana、亚心形扁藻Platymonassubcordiformis、舟形藻Navicula的生长抑制状况，并研究其对藤壶二期无节幼虫的抑制活性，探索化合物结构与生物性能关系，以期筛选出高效、低毒的新型防污剂。

1 实验材料

1.1 仪器与试剂

主要仪器：智能气候培养箱，高压灭菌锅，紫外分光光度计，血球计数板，LED光源。实验采用的浮游生物种类：球等鞭金藻，亚心形扁藻，舟形藻(取自海南大学海洋学院)；藤壶幼虫。所用药品均为市售分析纯，使用前未作处理。

13种受试化合物2-(N-芳基氨甲基)苯并异噻唑啉-3-酮(纯度为95%以上)由1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)为原料合成得到[11](图1)。

图1 目标化合物Fig.1 Target compounds

1.2 藻类生长抑制试验

藻类的培养条件为：盐度为8%，温度为25±1 ℃，pH为8.0±0.5。培养基的主要成分：FeCl3·6H2O，NaH2PO4·H2O，Na2EDTA·2H2O，CuSO4·5H2O，Na2MoO4·2H2O，ZnSO4·7H2O，CoCl2·6H2O，MnCl2·4H2O，VB12和VB1。

通过紫外分光光度计全波长扫描获取藻液的最大吸收波长。球等鞭金藻、亚心形扁藻、舟形藻最大吸收波长分别为428, 680和342 nm。实验采用血球计数板，计数测得各稀释液的藻液浓度,并在最大吸收波长处测量各稀释液的吸光值，作出以吸光值为横坐标，藻液浓度为纵坐标的标准曲线[12]。

将培养的藻液用营养液稀释成一定浓度，使其吸光值在0.05～0.1之间，取200 mL配制好的待测藻液置于锥形瓶中。配制质量浓度为0.4 mg/mL的待测化合物，取1 mL加入到各锥形瓶，其中一个锥形瓶留作空白，每组均设3个平行实验。每隔12 h测定各锥形瓶吸光度值，通过标准曲线，绘制时间-藻液浓度曲线[12]。

1.3 藤壶的生物活性实验

海水取自海口市白沙门，经过滤、煮沸消毒后备用。藤壶采取后先清除表面的淤泥，放在黑暗处，阴干处理2 h后，放入1 000 mL大烧杯中并装入新鲜海水，阳光刺激1 h 后可获得大量藤壶二期无节幼虫。用LED灯照射，小心吸取烧杯上层的藤壶幼虫，置于另一烧杯中，加入过滤灭菌后的新鲜海水，严格控制藤壶幼虫的密度，培养温度约为25 ℃，供实验用。

通过预实验将目标化合物分别配制成质量浓度为2、4、6、8和10 mg/L的受试溶液，并设BIT和海水作为对照组。用滴管小心吸取藤壶幼虫，先用与各组实验质量浓度相同的毒液润洗后再放入培养皿中。每个培养皿中藤壶幼虫数为30只。分别在投入藤壶12和24 h后用体视显微镜观察幼虫存活情况[13-14]。当藤壶停止游动静止不动时作为藤壶死亡的判断标准[15]。

2 结果与讨论

2.1 藻类生长抑制实验结果分析

实验以加受试化合物藻液为实验组,以加BIT的藻液为对照组。根据标准曲线，测出不同作用周期藻液浓度的变化。

图2 化合物对球等鞭金藻的影响Fig.2 The impact of compounds on Isochrysis galbana

由图2可知，目标化合物对球等鞭金藻的生长具有一定抑制作用，当R不同时，对球等鞭金藻表现出不同的抑制活性。化合物b、c、d、h、i、j、l和m均具有良好的对球等鞭金藻的抑制活性，且抑制活性优于BIT，其中对甲基取代的化合物b和间甲基取代的化合物d的抑制活性最强，完全抑制球等鞭金藻的生长。无取代基的化合物a和间溴取代的化合物k对球等鞭金藻的抑制活性弱于BIT。对甲氧基取代的化合物e、对乙氧基取代的化合物f和对氯取代的化合物g对球等鞭金藻的抑制活性与BIT相当。同时可以看出，当R取代位置相同时，表现为供电子基团优于吸电子基团；当R取代位置不同时，通常表现为间位优于对位优于邻位。

目标化合物对亚心形扁藻的生长具有一定抑制作用(图3)。当R不同时，对亚心形扁藻表现出不同的抑制活性。由图3可见，化合物c、g、h、i、l和m表现出对亚心形扁藻很强的抑制活性，且抑制活性优于BIT，其中间氯取代的化合物i、对硝基取代的化合物l和间硝基取代的化合物m的抑制活性最强，完全抑制亚心形扁藻的生长。而对甲氧基取代的化合物e、对溴取代的化合物j和间溴取代的化合物k对亚心形扁藻的抑制活性弱于BIT。无取代基的化合物a、对甲基取代的化合物b、间甲基取代的化合物d及对乙氧基取代的化合物f对亚心形扁藻的抑制活性与BIT相当。同时可以看出，当R取代位置相同时，表现为吸电子基团优于供电子基团，且吸电子基团的电负性越大，抑制活性越好；当R取代位置不同时，通常表现为间位优于对位。

图3 化合物对亚心形扁藻的影响Fig.3 The impact of compounds on Platymonas subcordiformis

由图2～图4可以看出，13种化合物对球等鞭金藻、亚心形扁藻和舟形藻的生长都有一定的抑制作用，通常表现为间位取代优于对位取代。邻甲基取代的化合物c、间氯取代的化合物i、对硝基取代的化合物l和间硝基取代的化合物m对3种藻的生长抑制作用都优于BIT。其中，对甲基取代的b和间甲基取代的d对球等鞭金藻的生长抑制最强；而间氯取代的i、对硝基取代的l和间硝基取代的m对亚心形扁藻的生长抑制最强。间溴取代的化合物k对3种藻的生长抑制作用都弱于BIT，对乙氧基取代的化合物f对3种藻的生长抑制作用都与BIT相当。

比较实验中3种藻对化合物的耐受性，其中，舟形藻耐受性最高，球等鞭金藻和亚心形扁藻的耐受性较低。

图4 化合物对舟形藻的影响Fig.4 The impact of compounds on Navicula

2.2 藤壶的生物活性实验结果分析

根据实验所得不同质量浓度的受试液中死亡率的数据，分析各化合物对藤壶二期幼虫的急性毒性效应，以受试化合物质量浓度为横坐标，以培养时间12和24 h藤壶幼虫的死亡率为纵坐标，分别作图5和图6。

图5 化合物对藤壶幼虫的毒性效应(12 h)Fig.5 Chemical toxicity effect on barnacle larvae(12 h)

在培养周期为12 h实验中，受试液质量浓度为10 mg/L时，除化合物a、d、f和BIT外其他化合物对藤壶幼虫的致死率可达100%(图5)。其中在受试液质量浓度为8 mg/L时，化合物g和l对藤壶幼虫的致死率可达100%。同时，可以看出，随受试液质量浓度的不断增加，藤壶幼虫的死亡率在不断增加，且各化合物的增加趋势均优于BIT，也即藤壶幼虫对目标化合物的敏感性优于BIT，其中，当受试液质量浓度为2 mg/L时，化合物g和l对藤壶幼虫的致死率都不高，当受试质量浓度增加到8 mg/L时，藤壶幼虫均完全死亡，说明在2～8 mg/L之间，藤壶幼虫对2-(N-芳基氨甲基)苯并异噻唑啉-3-酮化合物极为敏感，微量化合物就会有明显的毒杀效果。

从图6可以看出，在培养周期为24 h实验中，受试液质量浓度为10 mg/L时除BIT外其他化合物对藤壶幼虫的致死率均达到100%，由此可见，各化合物对藤壶幼虫均有一定的毒杀作用，且毒杀效果优于BIT。同时，可以看出，随受试液质量浓度的不断增加，藤壶幼虫的死亡率在不断增加，在2-(N-芳基氨甲基)苯并异噻唑啉-3-酮化合物质量浓度为2～8 mg/L范围内，藤壶幼虫的死亡趋势最大。

图6 化合物对藤壶幼虫的毒性效应(24 h)Fig.6 Chemical toxicity effect on barnacle larvae (24 h)

由图5和图6都可以得出，随2-(N-芳基氨甲基)苯并异噻唑啉-3-酮化合物质量浓度的增加，藤壶幼虫的死亡率升高，各化合物对藤壶幼虫的毒性效应增强。分析图5和图6实验结果表明，在相同实验质量浓度下，24 h的致死率均大于12 h的致死率，这说明随时间的延长，各化合物对藤壶的毒性效应不断增强。同时，可以看出，12和24 h时，各化合物对藤壶幼虫的致死率变化趋势均远远大于BIT。

半数致死质量浓度(LC50)指使全部实验对象中的半数死亡所需的质量浓度，它是衡量毒性大小的重要参数[16-17]，采用概率单位法计算藤壶二期无节幼虫的半数致死质量浓度(LC50)如表1所示。

表1 13种有机化合物对网纹藤壶Ⅱ期无节幼虫的LC50Tab.1 The LC50 of thirteen benzoisothiazoles on barnacle larvae

从表1可看出，13种目标化合物对藤壶幼虫均有一定的毒性效应，各化合物实验周期为12和24 h的LC50均低于对照组BIT，证明受试化合物对藤壶幼虫的毒杀效果优于原料BIT。由实验周期为12和24 h的LC50可知，随作用时间的延长，化合物对藤壶幼虫的毒性作用不断增加。根据表1中各化合物的 LC50数值，表明LC50还与各化合物的结构有关，取代基R为吸电子基团的化合物其LC50值较供电子基团的化合物低，这说明R为吸电子基团时对藤壶幼虫的毒杀作用相对较好；当R为相同基团时，R的位置对该化合物的毒性作用也有差异，毒性效果通常表现为邻位取代优于间位取代优于对位取代。

3 结论

(1)2-(N-芳基氨甲基)苯并异噻唑啉-3-酮化合物对球等鞭金藻、亚心形扁藻和舟形藻的生长都有一定的抑制作用，通常表现为间位取代优于对位取代，其中化合物c、i、l和m对3种藻的生长抑制作用较强。分析各藻的耐受性表明，舟形藻耐受性最高，球等鞭金藻和亚心形扁藻的耐受性较低。

(2)2-(N-芳基氨甲基)苯并异噻唑啉-3-酮化合物对藤壶幼虫均具有一定的毒性作用，同时表现出在不同质量浓度区间敏感性存在差异。实验12和24 h的毒性效应数据表明，毒性作用随化合物质量浓度的增加以及作用时间的延长而提高。LC50数据表明当取代基R连接吸电子基团时对藤壶幼虫的毒性效果较连接供电子基团好。当连接相同R时，R的位置对化合物毒性作用也有一定影响，通常表现的是邻位优于间位优于对位。

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The inhibitory activities of marine plankton by 2-(N-arylaminomethyl)-3-oxo-benzo[d]isothiazoles

LIU Dong-dong1,2,3, SHI Jia-le1,2,3, HU Yue1,2,3, WANG Ai-ming1,2,3, WANG Xiang-hui4, LIN Qiang4, YANG Jian-xin*1,2,3

(1.CollegeofMaterialandChemicalEngineering,HainanUniversity,Haikou570228,China;2.KeyLaboratoryofTropicalBiologicalResourcesofMinistryofEducation,Haikou570228,China; 3.HainanProvincialFineChemicalEngineeringResearchCenter,Haikou570228,China;4.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HainanNormalUniversity,Haikou571158,China)

The growing inhibitory properties onIsochrysisgalbana,PlatymonassubcordiformisandNaviculaof thirteen 2-(N-arylaminomethyl)-3-oxo-benzo[d]isothiazoles were investigated, and the effects on biological activity of barnacle nauplii were also studied. The results indicate that the tested compounds have favourable growing inhibitory activities to the marine algas, and the better inhibitory activities are onIsochrysisgalbanaandPlatymonassubcordiformis. The results also indicate when the lowest concentration is 2.0 mg/L, the tested compounds show a favourable growing inhibitory activity on barnacle larvae except the compound g and l. The relationship between compounds’ structure and plankton growth inhibitory activity reveals that meta-substituent is better than para-substituent.

benzoisothiazoles; algae; barnacle; biological activity

10.3969/j.issn.1001-909X.2015.03.007.

2015-02-03

2015-05-06

国家自然科学基金项目资助(20962007)

刘冬东(1989-)，男，安徽六安市人，主要从事精细化学品的合成与分析研究。E-mail: gilliankelly@163.com

*通迅作者:杨建新(1971-)，男，教授，主要从事精细化学品的合成与分析以及荧光增白剂的合成方面的研究。E-mail:yangjxmail@sohu.com

TQ637.3

A

1001-909X(2015)03-0048-06

10.3969/j.issn.1001-909X.2015.03.007

刘冬东，施佳乐，胡玥，等. 2-(N-芳基氨甲基)苯并异噻唑啉酮类化合物对海洋浮游生物的生长抑制活性研究[J]. 海洋学研究,2015,33(3):48-53,

LIU Dong-dong, SHI Jia-le, HU Yue, et al. The inhibitory activities of marine plankton by 2-(N-arylaminomethyl)-3-oxo-benzo[d]isothiazoles[J]. Journal of Marine Sciences, 2015,33(3):48-53, doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2015.03.007.