表达hrpZPsg12基因的重组枯草芽孢杆菌工程菌株构建及其生防活性评价

王 雪，田 佳，徐琳琳，卢宝慧，杨丽娜，高 洁

(吉林农业大学 农学院，吉林 长春130118)

表达hrpZPsg12基因的重组枯草芽孢杆菌工程菌株构建及其生防活性评价

王 雪，田 佳，徐琳琳，卢宝慧，杨丽娜，高 洁

(吉林农业大学 农学院，吉林 长春130118)

【目的】 提高生防枯草芽孢杆菌JN209的稳定性及生防活性。【方法】 利用基因工程技术，构建含hrpZPsg12基因的分泌表达载体，采用电转化方法将从大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)中克隆到的hrpZPsg12基因转化至枯草芽孢杆菌JN209中，同时采用抑菌圈法测定宿主菌与基因工程菌抑菌活性的变化，评价其作为生物农药在田间对烟草病毒病的生防效果。【结果】 成功构建了重组枯草芽孢杆菌基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12。抑菌活性分析表明，基因工程菌株在保持原始宿主菌株抑菌活性的同时，对部分靶标菌的抑菌效果有明显提高。烟草病毒病田间小区防治试验表明：与原始宿主菌JN209相比，新构建的基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12对烟草病毒病的防效有明显提高。【结论】 改良的基因工程菌在抑菌谱和抑菌活性方面均有明显提高，同时对烟草病毒病也有较好的防治效果，可进一步开发为新型生物农药。

hrpZPsg12；枯草芽孢杆菌；基因工程菌；抑菌效果；生物农药

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，简称Bs)是自然界中广泛存在的具有内生芽孢的革兰氏阳性细菌，其生理特性丰富多样，极易分离培养，对人畜无毒无害，能产生40多种具有不同结构的抗菌素，具有显著的抗菌活性和极强的抗逆能力，已作为益生菌和生物防治制剂广泛应用在医药、畜牧、水产及农作物种植等领域，是目前微生物杀菌剂中应用最为成功的细菌之一[1-3]。Harpin蛋白是由革兰氏阴性植物病原细菌产生的一类能激发植物过敏反应的蛋白，由hrp基因编码，其可诱导植物体内一系列基因的表达，激活植物自身的生长系统和防卫系统，从而使植物能抵御多种病虫害的侵染和逆境胁迫，并获得促进生长发育和提高产量的效果[4-5]。然而由于天然型微生物菌剂存在持效期短、作用对象单一、易受环境影响、竞争存活力有限等缺陷，采用基因工程技术对生防菌株进行遗传改良，进一步提高生防菌株的生防效果、拮抗性能，扩大其防治对象，已成为目前生物防治研究的热点[6-7]。随着分子生物学和基因工程的发展，越来越多的枯草芽孢杆菌被用作基因工程的表达宿主菌，并已表现出良好的应用前景。田大伟等[8]发现,以生防促生芽孢杆菌为宿主菌，可外泌表达Harpin蛋白激发子的基因工程菌，对水稻白叶枯病的防治效果较出发菌株显著提高，同时还可促进植物生长。魏利辉等[9]研究发现，将表达载体pHTPOW转入枯草芽孢杆菌168得到的工程菌株具有促进番茄生长和抑制根结线虫的作用。菌株JN209是吉林农业大学植物病害综合治理实验室分离得到的1个对多种植物病原菌有防治效果的枯草芽孢杆菌菌株，为了更好地开发利用该菌株，提高其生防效果，本研究将从大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)中克隆到的hrpZPsg12基因转化至枯草芽孢杆菌JN209中，构建新型基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12，并通过抑菌圈法测定其对部分植物病原细菌的抑菌作用，明确其对烟草病毒病的生防效果，为进一步开发研制新型、高效的生物农药奠定理论基础，并提供新的研究视角。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株和载体 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JN209菌株，由吉林农业大学植物病害综合治理实验室保存并提供。

分泌表达载体pWB980，由天津工业生物技术研究所馈赠。

1.1.2 供试植物病原细菌 烟草野火病菌(Pseudomonassyringaepv.tabaci)、大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)、芥菜细菌性叶斑病菌(Xanthomonascampestrispv.armoraciae)、万寿菊细菌性叶斑病菌(Pseudomonassyringaepv.tagetis)、防风叶腐病菌(Pseudomonasviridiflavapv.pastinacae)、黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonassyringaepv.lachrymans)、西瓜细菌性果斑病菌(Acidovoraxcirrulli)，均由吉林农业大学植物病害综合治理实验室保存并提供。

1.1.3 供试药剂和烟草品种 供试药剂10%宁南霉素SPX，德强生物股份有限公司产品；感病毒病烟草品种“青农1号”，农家品种。

1.1.4 供试酶和试剂 ExTaqDNA聚合酶、dNTP、T4 DNA连接酶、核酸限制性内切酶XbaⅠ和PstⅠ,均购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA凝胶纯化试剂盒,购自上海生物工程技术公司；其余均为国产或进口分析纯试剂。

1.1.5 供试培养基 NA培养基、LB培养基、丰富表达培养基、枯草芽孢杆菌电转化培养基。

1.2 方 法

1.2.1hrpZPsg12基因的克隆 以含有pGEX-4T-hrpZPsg12的基因为模板PCR扩增hrpZPsg12基因。hrpZPsg12的扩增引物为：上游引物P1，5′-CTAGTCTAGAATGCAGAGTCTCAGTCTTA-ACA-3′ ；下游引物P2，5′-AAAACTGCAGTCAGGCAGCAGCC-3′。上、下游引物分别加XbaⅠ和PstⅠ酶切位点(底部划线处为酶切位点)。

1.2.2 pWB980-hrpZPsg12分泌表达载体的构建hrpZPsg12基因PCR产物经纯化回收后用XbaⅠ和PstⅠ双酶切，用T4 DNA连接酶将hrpZPsg12基因连接到经相同双酶切的分泌表达载体pWB980中，获得重组表达载体pWB980-hrpZPsg12。转化pWB980-hrpZPsg12到大肠杆菌DH5α细胞，在含有50 μg/mL卡那霉素LB平板上筛选阳性转化子并加以验证。

1.2.3 高效表达重组枯草芽孢杆菌hrpZPsg12基因工程菌的构建及阳性克隆筛选 以生防枯草芽孢杆菌JN209作为宿主，通过电转化法将构建好的表达载体pWB980-hrpZPsg12转入宿主菌JN209中，在含卡那霉素的选择压力下筛选阳性重组子。

1.2.4 宿主菌JN209与基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12发酵产物抑菌谱的比较 将JN209及其基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12分别接种于20 mL LB培养基中，28 ℃、 200 r/min过夜培养至OD600为0.8，将发酵液用于抑菌谱测定，采用抑菌圈法[10-11]测定其对病原细菌的抑菌效果。将LB固体培养基融化，接近室温时，将2 mL靶标细菌发酵液与100 mL LB培养基混合后倒平板，在无菌操作台中待平板自然凝固后，打取直径为9.0 mm的圆孔，用消毒后的镊子将圆形培养基取出，然后取10 μL宿主菌JN209发酵液和JN209/pWB980-hrpZPsg12发酵液缓慢注入圆孔中，放入25 ℃培养箱中培养，48 h后量取抑菌圈直径，每个处理均设3次重复。

1.2.5 宿主菌JN209与基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12对烟草病毒病的生防效果评价 (1)试验设计。结合生产实际，测定新构建的基因工程菌对烟草生产上的主要病害烟草病毒病的生防效果。试验在吉林省农安县进行，选取自然发生烟草病毒病的烟草种植区，将JN209及其基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12分别接种于20 mL LB培养基中，28 ℃、200 r/min过夜培养至OD600为0.8，发酵液用于田间生防效果测定。试验共设4个处理：①宿主菌JN209发酵液处理；②基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12发酵液处理；③宁南霉素900 g/hm2处理；④清水对照。每小区面积20 m2，均设3次重复。试验用量为每小区均匀喷施600 mL生防菌发酵液和等量对照药剂，每隔5 d喷药1次，共喷药3次。

(2)试验调查。以株为单位调查各小区的全部烟株，每次施药5 d后进行调查，共调查3次。按病毒病分级标准，调查各处理烟株病毒病的发病率、病情指数，观察有无药害，计算防效[12-13]。

烟草病毒病调查分级标准如下[14]：0级，全株无病；1级，心叶脉明或轻微花叶，病株无明显矮化；3级，1/3叶片花叶但不变形，或病株矮化为正常株高的3/4以上；5级，1/3～1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或病株矮化为正常株高的2/3～3/4；7级，1/2～2/3叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或病株矮化为正常株高的1/2～2/3；9级，全株叶片花叶，严重变形或坏死，或病株矮化为正常株高的1/2以上。

发病率=(发病株数/调查总株数)×100%；

病情指数=∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)×100；

防治效果=(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数×100%。

试验数据采用DPS 7.05进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 hrpZPsg12基因的克隆

以pGEX-4T-hrpZPsg12质粒DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小为 1 026 bp的基因片段(图1)，测序结果与目的基因hrpZPsg12序列完全匹配。

图1 hrpZPsg12基因的PCR检测M.DL 2000 DNA Marker；1.hrpZPsg12基因扩增产物Fig.1 PCR detection of hrpZPsg12 gene M.DL 2000 DNA Marker；1.PCR products of hrpZPsg12

图2 重组质粒pWB980-hrpZPsg12的酶切鉴定M．DL 2000 DNA Marker；1.XbaⅠ/PstⅠ双酶切Fig.2 Restriction analysis of recombinant pWB980-hrpZPsg12 plasmid M．DL 2000 DNA Marker；1.Digested by XbaⅠand PstⅠ

2.2 pWB980-hrpZPsg12分泌表达载体的构建

分别提取质粒pMD18-hrpZPsg12以及pWB980，对提取后的质粒进行XbaⅠ/PstⅠ双酶切。切胶回收小片段后进行片段连接，连接产物转化入大肠杆菌DH5α。在卡那霉素(50 μg/mL)平板上筛选转化子，对阳性转化子进行菌液PCR检测后提取转化后的阳性重组子的质粒进行双酶切检测，图2结果表明，pWB980-hrpZPsg12重组质粒构建成功。

2.3 高效表达重组枯草芽孢杆菌hrpZPsg12基因工程菌的构建及阳性克隆筛选

将构建好的表达载体pWB980-hrpZPsg12，通过电转化法转入宿主枯草芽孢杆菌JN209中，在含卡那霉素的选择压力下初筛出阳性重组子。提取质粒后以引物P1、P2对其进行PCR检测验证，结果(图3)表明：表达载体pWB980-hrpZPsg12向枯草芽孢杆菌JN209转化成功，将新构建的基因工程菌命名为JN209/pWB980-hrpZPsg12。

2.4 宿主菌JN209与基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12发酵产物的抑菌谱

从表1可知，原始宿主菌JN209对供试7种植物病原细菌的抑制作用表现不同，仅对烟草野火病菌和芥菜细菌性叶斑病菌有一定的抑制效果，而新构建的基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12对供试的多种靶标植物病原细菌的抑菌效果均较宿主菌

有不同程度的增强，抑菌谱扩展，尤其提高了对万寿菊细菌性叶斑病菌(Pseudomonassyringaepv.tagetis)、烟草野火病菌(Pseudomonassyringaepv.tabaci)、黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonassyrin-gaepv.lachrymans)的抑菌效果，对万寿菊细菌性叶斑病菌的抑制效果最佳，抑菌圈直径为24.83 mm，显著高于其他病原细菌，对西瓜细菌性果斑病菌的抑制效果无明显提高。

图3 JN209/pWB980-hrpZPsg12的PCR检测 M.DL 2000 DNA Marker；1～3.引物P1/P2扩增结果
Fig.3 PCR detection of JN209/pWB980-hrpZPsg12plasmid M.DL 2000 DNA Marker；1-3.Amplification of primer P1/P2

表1 宿主菌JN209 及基因工程菌 JN209/pWB980-hrpZPsg12对7种植物病原细菌的抑菌效果Table 1 Comparison of inhibition effects of strains JN209 and JN209/pWB980-hrpZPsg12against 7 plant pathogenic bacteria

注：*同列数据后不同小写字母表示在P=0.05水平差异显著。表2同。

Note：Different lowercase letters indicate significant difference atP=0.05 level.The same for table 2.

2.5 宿主菌JN209与基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12对烟草病毒病生防效果的评价

烟草病毒病是目前烟草生产上的主要病害，分别用原始宿主菌JN209的发酵液和新构建的基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12的发酵液以及防治病毒病的药剂宁南霉素处理田间自然发病的烟草植株，连续用药3次，每次用药后5 d调查病害的发展情况，调查结果见表2。由表2可以看出，经基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12发酵液处理后的烟草植株病毒病得到了明显的控制，病害扩展不明显，3次施药后平均防效分别达到了71.46%，84.91%和59.60%，均较原始宿主菌防效有所提高，尤其是发病初期施药防治效果更为明显，与10%宁南霉素SPX药剂对照组差异显著，可考虑进一步开发为新型的生物农药。

表2 不同处理对烟草病毒病的防治效果Table 2 Biocontrol effects of different treatments on tobacco virus diseases

3 结论与讨论

本研究通过基因工程手段构建了含hrpZPsg12基因的分泌表达载体pWB980-hrpZPsg12，采用电转化方法，将从大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)中克隆到的hrpZPsg12基因转化至具有生防活性的枯草芽孢杆菌JN209中，成功构建了具有双重活性的重组枯草芽孢杆菌基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12。在成功构建工程菌的基础上，比较了原始宿主菌株与基因工程菌株在抑菌效果方面的差异，结果表明：与原始宿主菌相比,基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12对除西瓜细菌性果斑病菌外的其余6种供试植物病原细菌的抑菌效果有明显增强，尤其提高了对万寿菊细菌性叶斑病菌(Pseudomonassyringaepv.tagetis)、烟草野火病菌(Pseudomonassyringaepv.tabaci)、黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonassyringaepv.lachrymans)的抑菌效果，抑菌圈直径均大于20 mm。

目前，在烤烟生产上病毒病以复合性侵染危害为主，给烟叶生产造成了严重损失，化学药剂防治烟草病毒病尚有一定局限性，因此提高烟草植株自身的抗病毒能力，是防治病毒病最科学、有效的途径。而蛋白农药作为一种新型生物农药，能有效激发植物自身的抗病防虫基因表达，同时促进植物生长发育[15-16]。在本研究中，利用新构建的基因工程菌的发酵液处理感染烟草病毒病的烟草植株，以期诱导其抗病基因的表达，增强植株抗病能力。结果表明，与原始宿主菌JN209相比，新构建的基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12对烟草病毒病的防效有明显提高，与对照药剂处理间差异显著。另外，从施药时间来看，新构建工程菌的发酵液于发病初期处理的防治效果更为明显，这可能与Harpin蛋白所表达的诱导抗性有关，此类蛋白在生物防治中所起到的作用可能主要体现在预防保护方面，其作用机理尚有待进一步深入研究。

本研究采用现代生物技术对生防菌进行遗传改良，将表达Harpin蛋白的hrpZ基因成功导入生防枯草芽孢杆菌中，使新构建的枯草芽孢杆菌基因工程菌在保持原始菌株生物学特性的同时，抑菌谱和抑菌能力均较原始菌株有所增强，体现了生物技术在生防细菌遗传改良中的应用潜力，为进一步研究和开发新型微生物农药创造了条件。

[1] 陈向东.枯草芽孢杆菌作为生防制剂在农业上的应用 [J].微生物学通报,2013,40(7):1323-1324.

Chen X D.Application ofBacillussubtilisin agriculture as biocontrol agent [J].Microbiology China,2013,40(7):1323-1324.(in Chinese)

[2] 黄 曦,许兰兰,黄荣韶,等.枯草芽孢杆菌在抑制植物病原菌中的研究进展 [J].生物技术通报,2010(1):24-29.

Huang X,Xu L L,Huang R S,et al.Research advance in controlling plant diseases byBacillussubtilis[J].Biotechnology Bulletin,2010(1):24-29.(in Chinese)

[3] Mishra S,Arora N K.Evaluation of rhizosphericPseudomonasandBacillusas biocontrol tool forXanthomonascampestrispv.campestris[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2012,28(2):693-702.

[4] Lindgren P B.The role of hrp genes during plant-bacterial interactions [J].Annu Rev Phytop Athol,1997,35:129-152.

[5] He S Y,Huang H C,Collmer A.Pseudomonassyringaepv.SyringaeharpinPss:A protein that is secreted via theHrppathway and elicits the hypersensitive response in plants [J].Cell,1993,73(7):1255-1266.

[6] 罗楚平,陈志谊,刘永锋,等.利用基因工程改良枯草芽孢杆菌 [J].江苏农业学报,2008,24(2):204-209.

Luo C P,Chen Z Y,Liu Y F,et al.Enhancement of biocontrol performance ofBacillussubtilisby genetic engineering [J].Jiangsu Journal of Agr Sci,2008,24(2):204-209.(in Chinese)

[7] 陈中义,张 杰,曹景萍,等.杀虫防病基因工程枯草芽孢杆菌的构建 [J].生物工程学报,1999,15(2):215-220.

Chen Z Y,Zhang J,Cao J P,et al.Construction of genetically engineered strains ofBacillussubtilisagainst insect pests and plant pathogens [J].Chinese Journal of Biotechnology,1999,15(2):215-220.(in Chinese)

[8] 田大伟,乔俊卿,王伟舵,等.表达Harpin蛋白的芽孢杆菌工程菌防治水稻白叶枯病的研究 [J].中国生物防治学报,2012,28(2):250-254.

Tian D W,Qiao J Q,Wang W D,et al.Biocontrol efficacy on rice bacterial leaf blight of genetically engineeredBacillusexpressing Harpin [J].Chinese Journal of Biological Control,2012,28(2):250-254.(in Chinese)

[9] 魏利辉,周冬梅,王云鹏,等.枯草芽孢杆菌168的遗传修饰菌株对番茄根结线虫病的生防作用 [J].农业生物技术学报,2011,19(4):740-745.

Wei L H,Zhou D M,Wang Y P,et al.Biocontrol effection of genetically-modified strains derived fromBacillussubtilis168 onMeloidogyneincognita[J].Journal of Agricultural Biotechnology,2011,19(4):740-745.(in Chinese)

[10] 雷春霞,冯云利,奚家勤,等.拮抗烟草青枯病菌的烟草内生细菌系统多样性及趋化性分析 [J].云南大学学报:自然科学版,2012,34(1):99-106.

Lei C X,Feng Y L,Xi J Q,et al.Phylogenetic diversity of the antagonistic endophytic bacteria of tobacco againstRalstoniasolanacearumand their chemotaxis analysis [J].Journal of Yunnan University:Natural Science Edition,2012,34(1):99-106.(in Chinese)

[11] 单文荣,李俊霞,刘花粉,等.滤纸片法筛选不同活性物对棉花黄萎病菌抑制效果研究 [J].中国农学通报,2010,26(19):285-289.

Shan W R,Li J X,Liu H F,et al.Study on the inhibitory effects of different active materials screened by the filter papen on cotton verticillium wilt [J].Chinese Agricultural Science Bulletin,2010,26(19):285-289.(in Chinese)

[12] 李宏光,钟 权,张 赛,等.8种农药防治烟草花叶病的田间药效试验 [J].江西农业学报,2012,24(4):100-101.

Li H G,Zhong Q,Zhang S,et al.Field control effect of 8 kinds of medicaments on tobacco mosaic virus disease [J].Acta Agriculturae Jiangxi,2012,24(4):100-101.(in Chinese)

[13] 李应金,陈惠明,李 强,等.防治烟草病毒病田间对比药效试验 [J].农药,2003,42(9):32-33.

Li Y J,Chen H M,Li Q,et al.Efficacy test of controlling tobacco virus disease in field [J].Pesticides,2003,42(9):32-33.(in Chinese)

[14] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 23222-2008 烟草病虫害分级及调查方法 [S].北京:中国标准出版社,2008.

General Administration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China.GB/T 23222-2008 Grade and investigation of tobacco disease and insect pests [S].Beijing:China Standard Press,2008.(in Chinese)

[15] 邱德文.生物农药研究进展与未来展望 [J].植物保护,2013,39(5):81-89.

Qiu D W.Research progress and prospect of bio-pesticides [J].Plant Protection,2013,39(5):81-89.(in Chinese)

[16] Chen Y C.Research and application of botanical pesticides in control of tobacco pest [J].Plant Diseases and Pests,2010,1(1):46-49,56.

Construction and biocontrol activity of genetic engineeringBacillussubtilisstrain withhrpZPsg12gene

WANG Xue,TIAN Jia,XU Lin-lin,LU Bao-hui,YANG Li-na,GAO Jie

(CollegeofAgronomy,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 The objective of this study was to improve the stabilities and biocontrol activities ofBacillussubtilisstrains JN209.【Method】Bacillussubtilissecretory expression vector was constructed by engineering approach,andhrpZPsg12fromPseudomonassyringaepv.glycineawas transferred intoBacillussubtilisstrain JN209 by electroporation engineering approach.The inhibition activity of JN209 and genetic engineering bacterium JN209/pWB980-hrpZPsg12against seven plant pathogenic bacteria was determined by inhibition zone method,and the biocontrol effects on tobacco virus diseases was appraised.【Result】 Genetic engineering bacterium JN209/pWB980-hrpZPsg12was successfully constructed.The antibacterial activities against plant pathogenic bacteria were significantly improved in genetic engineering strains.The field trial of controlling tobacco virus disease showed that genetic engineering strains JN209/pWB980-hrpZPsg12had better control efficiency than the host strain.【Conclusion】 Both inhibition spectrum and antibacterial activity were improved significantly in genetic engineering bacteria.This study provides reference for the further development of new biological pesticides.

hrpZPsg12;Bacillussubtilis;genetic engineering strain;inhibitory effect;biological pesticide

时间:2015-10-13 08:46

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.021

2014-03-26

吉林省科技发展计划项目(20090211)；吉林农业大学博士科研启动基金项目(201106)

王 雪(1981-),女,辽宁沈阳人，讲师,博士,主要从事植物病害生物防治研究。E-mail:wangxue813@126.com

高 洁(1964-),女,吉林梨树人，教授,博士,博士生导师,主要从事植物细菌病害及植物病害生物防治研究。 E-mail:jiegao115@126.com

Q78;S482.2+92

A

1671-9387(2015)11-0139-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.042.html