高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定莕菜中白桦脂酸的含量

蔡 颖 (南京市白下区建中中医院药剂科，南京 210004)

莕菜(Nymphoides peltatdum(Gmel.)O.Kunt)，又称荇菜、水葵、水镜草、水荷叶，为睡菜科植物莕菜的全草，具有清热、解毒、消肿、利尿之效，临床主要用于治寒热、热淋、痈肿、火丹［1］。白桦脂酸为莕菜的主要有效成分之一，具有抗菌、降血脂及抗疟疾等活性，对黑色素瘤及脑肿瘤等多种肿瘤有强烈的毒杀效应，且对正细胞无杀伤力，为治疗艾滋病、肿瘤的新药［2］。本文参考文献，建立了高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD 法)测定莕菜中白桦脂酸的含量［3-11］。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100 型高效液相色谱议，Chem-stations 工作站(美国Agilent 公司);梅特勒-托利多AB135-S 电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多集团);美国ALLtech 2000 型蒸发光散射检测器;SG1200H 超声波清洗器(上海冠特超声仪器厂)，DL-1溶剂过滤器(天津市东康科技有限公司)。

1.2 药品与试剂

白桦脂酸对照品经归一法测定含量为98.30%(天津马克生物技术有限公司提供，批号:BH20100409);莕菜药材采摘自云南省丽江市，经南京市中医药大学中药鉴定教研室鉴定为为睡菜科植物莕菜Nymphoides peltatdum(Gmel.)O.Kunt 的全草，现存于南京市中医药大学，标本号为b20110453。甲醇为色谱纯，水为高纯水，所用其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为甲醇-0.2%甲酸(V ∶V =80 ∶20);流速为1.0 ml/min;体积流量为1.0 ml/min;柱温为30 ℃。蒸发光散射检测器参数:漂移管温度为40 ℃，氮气流速为2.0 L/min。在此色谱条件，白桦脂酸和样品中的其他物质可以达到良好的分离，见图1。

2.2 溶液的制备

图1 白桦脂酸的HPLC 图Fig 1 HPLC chromatograms of betulinic acid

2.2.1 对照品溶液的制备:精密称取白桦脂酸对照品2.6 mg适量，置于100 ml 容量瓶中，加入甲醇溶解，并稀释至刻度，振荡摇匀。加甲醇稀释至刻度，摇匀，浓度为0.026 mg/ml，作为对照品储备液。精密量取5 ml 于10 ml 的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，浓度为0.013 mg/ml，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备:取莕菜样品1 g，过40 目筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇100 ml，密塞，称定质量，超声处理(250 W，40 kHz)提取30 min，再称定质量，加甲醇补足减失质量，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 线性关系:分别精密吸取白桦脂酸对照品溶液(0.013 mg/ml)1、2、3、4、5 ml 置于100 ml 容量瓶中，加甲醇稀释置刻度，摇匀，精密吸取10 μl，进样测定峰面积。以峰面积常用对数值为为纵坐标Y，以进样质量浓度的常用对数值为横坐标X，进行线性回归，得回归方程为白桦脂酸Y=5 689.6X-3.85(r=0.999 7)。结果表明，白桦脂酸在0.130 ～0.650 μg/ml范围内线性关系良好。

2.2.4 精密度试验:精密量取白桦脂酸对照品溶液10 μl，按“2.1”项下色谱条件，重复进样5 次，测定峰面积，结果白桦脂酸含量的相对标准偏差(RSD)为1.02%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验:取供试品溶液，按“2.2.2”项下方法配置，放置0、2、4、6、8 h 后，精密吸取样品溶液1 μl 进样，按“2.1”项下色谱条件测定，结果白桦脂酸含量的RSD为0.86%，表明供试品在8 h 内稳定性，可以满足试验要求。

2.2.6 重复性试验:分别取莕菜药材粉末样品6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果测定白桦脂酸含量的RSD为1.20%，表明该方法的重复性符合要求，适合样品中白桦脂酸的提取和分析，见表1。

表1 重复性试验结果Tab 1 Repeatability of test results

2.2.7 加样回收试验:精密称取已知含量莕菜药材6 份，每份约0.5 g，精密测定后，加入白桦脂酸对照品储备液1.0 ml按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，并按上述色谱条件进行分析测定，计算回收率。试验结果表明，该测定方法回收率良好，见表2。

表2 白桦脂酸加样回收试验结果(n=6)Tab 2 Results of the recovery test for betulinic Acid(n=6)

2.2.8 样品测定:按“2.1”项下色谱条件，精密吸取白桦脂酸对照品溶液，供试品溶液各10 μl，分别测定峰面积，按外标法计算白桦脂酸的含量，测得白桦脂酸的含量为0.517 μg/g。

3 讨论

3.1 超声提取时间的选择

以超声20、30、45 和60 min 进行对比，结果表明，超声30 min已经提取完全，故选择超声30 min 作为本方法提取时间.

3.2 提取溶剂和方法的筛选

在供试品溶液制备过程中，对甲醇、无水乙醇、95%乙醇等不同的提取溶剂进行优选，最后根据提取效果选择了甲醇作为提取溶剂;对超声处理、回流、索氏提取、冷浸等不同的提取方法进行优选，考虑到方法的简捷性，最终选择回流提取作为供试品溶液的提取方法［3，12］。

3.3 流动相的筛选

考察了甲醇-1%冰醋酸水溶液(V∶V=37 ∶63)、甲醇-0.1%甲酸水溶液(V∶V=30 ∶70)、甲醇-0.4%磷酸(V ∶V=47∶53)等组成的流动相，实验结果表明，以甲醇-0.2% 甲酸(V∶V=80∶20)为流动相时，分离效果较好，确定为流动相系统。

3.4 测定方法的筛选

白桦脂酸为5 环3 萜类成分，分子中仅存在一个双键，在紫外光线(UV)波长为207 nm 处有末端吸收。采用HPLC-UA法进行检测时，受流动相影响较大，基线不够理想，检测的灵敏度较低;采用HPLC-ELSD 法进行检测时，可以使流动相在检测器内挥发成气体，只对挥发性小于流动相的目标成分产生影响，从而消除流动相在末端吸收带来的影响，获得理想的基线和灵敏的检测度［4］。

3.5 检测器参数的选择

雾化气体流速及漂移管温度是影响ELSD 检测的2 个重要可调节参数。雾化气体流速太低，会形成大量液滴，导致噪音信号;流速太高，导致信号响应降低。漂移管温度太低，溶剂挥发不够完全;太高，则会使检测器响应下降［5］。通过不同漂移管温度和不同流速下白桦脂酸信号的对比和基线情况，确定了ELSD 检测器的参数。

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