近红外光谱法快速测定女贞子中特女贞苷的含量

张迪文，白 雁，谢彩侠，胡小莉，郝 敏，谢惠英

河南中医学院药学院，郑州 450046

女贞子(Fructus Ligustri Lucidum)是木犀科植物女贞(Ligustrum lucidum Ait.)的干燥成熟果实，是一味传统的扶正固本药物，具有滋补肝肾、明目乌发之功效［1］。临床主要用于眩晕耳鸣、腰膝酸软、须发早白、目暗不明等症［2］。女贞子含有多种化学成分，最先发现的是含有较高含量的齐墩果酸、乙酰齐墩果酸、熊果酸等［3］。2010 年版《中国药典》收载的女贞子药材的标准是以高效液相色谱法测定特女贞苷含量。供试品的制备要经过精密称定，加热回流，补足失重等多个步骤，处理过程较为繁琐复杂。

近红外光谱技术结合了光谱衡量技术、化学计量学技术和基础测量技术，能够快速、高效、无损的对样品进行定性和定量分析［4-6］。近红外光谱技术通过对样品一次测定，就可以在几秒至几分钟内同时测定一个样品的几种至十几种性质数据［7］。本文对女贞子药材中指标性成分特女贞苷的含量做了相关研究，并利用近红外光谱技术上述优点，结合偏最小二乘法建立女贞子药材中特女贞苷含量的定量分析模型，为女贞子药材的质量检测与分析评价提供了快捷简便的新方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Nicolet 6700 型傅里叶变换近红外光谱仪(配有InGaAs 检测器，50 mL 标准石英样品杯，漫反射积分球，样品旋转器以及OMNIC 光谱采集软件，TQ Analyst 8.0 分析软件，美国Thermo 公司)，SZ-93 型自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)，FW-200型高速药材粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)，101A-2B 型电热鼓风干燥箱(上海实验仪器厂有限公司)，METTLER TOLEDO AL204 型1/万分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，HS-6150 型超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)。

1.2 试药

女贞子药材为采购于四川、湖南、浙江、河南4个产地共91 份样品，由河南中医学院董诚明教授鉴定为木犀科女贞属植物女贞(Ligustrum lucidum Ait.)的干燥成熟果实。

乙醇、蒸馏水均为分析纯，甲醇为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 近红外光谱的采集

取上述91 份样品适量，粉碎，过40 目筛，取约5 g 粉末装入石英杯，混合均匀，采用积分球漫反射，以空气为参比，扣除背景采集光谱图。采集参数如下:分辨率8 cm-1，光谱采集范围12000～4000 cm-1，扫描次数64 次，每次扫描背景间隔20 min。温度25～28 ℃，相对湿度17%～20%。每份样品重复扫描3 次，求平均光谱，91 份样品的近红外光谱叠加图见图1。

图1 91 份女贞子的近红外原始光谱叠加图Fig.1 The overlaid near-infrared reflectance spectra of 91 samples

2.2 特女贞苷参考值的HPLC 测定

参照2010 年版《中国药典》一部中女贞子项下特女贞苷的HPLC 含量测定方法进行测定。本实验采用的色谱条件:Dikma Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相:甲醇-水(40∶60)，柱温:30 ℃，进样量:10 μL，流速:1 mL/min，检测波长:224 nm。以保留时间定性，峰面积定量，外标法计算。每份样品平行测定两次，计算平均值，并以其作为参考值，女贞子药材中特女贞苷的含量结果见表1。

表1 91 份女贞子药材中特女贞苷含量Table 1 The content of specnuezhenide in 91 samples

2.3 建立特女贞苷近红外定量分析模型

2.3.1 校正集和验证集样品的选择

根据女贞子药材中特女贞苷含量分布情况，从91 份样品中选取71 份具有代表性的样品组成校正集，用于建立近红外模型;其余20 份样品组成验证集，对模型进行验证。校正集与验证集的选择原则为验证集的特女贞苷含量分布范围应在校正集的特女贞苷含量分布范围之内。表2 为校正集和验证集样品的特女贞苷含量的分布范围。

表2 校正集与验证集样品的特女贞苷含量分布范围Table 2 The content distribution of calibration set and validation set for specnuezhenide content

2.3.2 光谱预处理方法的选择

在建立近红外定量分析模型前，首先要对样品的近红外原始吸收光谱进行预处理，为了消除光谱噪音、颗粒散射、光谱漂移等非线性因素对定量结果的影响。常用的预处理方法有多元散射校正法(MSC)，标准归一化法(SNV)，一阶导数法(First derivative)，二阶导数法(Second derivative)，Savitzky-Golay 滤波法，Norris derivative 滤波法［8］等。表3为使用不同的预处理方法后，校正集内部交叉验证相关系数(R2)、校正均方差(RMSEC)及验证集预测均方差(RMSEP)的比较。其中，R2越接近1 模型越好，真实值和预测值相关性越好;RMSEC 和RMSEP越小且越接近越好，所建模型的适用性越强，预测结果越准确［9］;同时，要保证RMSEC 应小于RMSEP，否则会出现过拟合现象［10］。本实验结果以SNV+SD+ND 预处理效果最好，可以消除样品光谱噪音以及漂移所造成的影响，强化样品近红外光谱的谱带特征，并克服样品谱带重叠的现象，因此选用此法为光谱预处理的最佳方法。

表3 不同预处理方法对定量模型性能的影响Table 3 The effects of different pretreatment methods on quantitative model performance

SNV+SD+ND 最佳光谱预处理方法处理后得到的近红外光谱见图2。

图2 预处理后的近红外光谱Fig.2 The near-infrared reflectance spectra after pretreatment

2.3.3 建模波段的选择

在建立模型时需要不断地选择波段范围以调整模型的准确性，以R2和RMSECV 为指标，其中，R2越接近1，RMSECV 越小，模型越好。采用最佳预处理方法，即SNV+SD+ND，对不同的波段进行手动优化比较，选择最佳波段范围。结果见表4，在波段区间4007.35～9987.74 cm-1，R2最接近1，RMSECV最小，故此波段选为最佳建模波段。

表4 不同光谱范围对R2 和RMSECV 的影响Table 4 The effects of different spectral range on R2 and RMSECV

2.3.4 主成分数的选择

在建模过程中，采用不同的主成分数，模型的预测能力不同，主成分数太多，模型包含过多的测量噪音，校正过程会出现过拟合现象;主成分数太少，建模信息不全，预测能力差［11］。采用内部交叉验证考察主成分数对内部交叉验证均方差(RESECV)的影响，RESECV 随主成分数变化的曲线见图3。从图中可以看出，当偏最小二乘法因子数为7 时，RESECV 最小，为最佳建模主成分数。

图3 主成分数对RMSECV 的影响Fig.3 The RMSECV value with different factors for specnuezhenide

2.4 定量模型的建立

运用TQ Analyst8.0 分析软件，91 份样品进行建模，对光谱采用SNV+SD+ND 预处理方法，在4007.35～9987.74 cm-1波段范围，7 个主成分数进行建模。用校正集样品进行内部验证，R2为0.98075，RMSEC 为0.216，RMSEP 为0.223，RMSECV 为0.52276。特女贞苷的NIR 预测值与HPLC参考值的相关图见图4，偏差图见图5，可以看出预测值与参考值的相关性较高，且结果很接近，模型的性能较好，该模型可以用于女贞子药材中特女贞苷的定量分析。

图4 特女贞苷NIR 预测值与HPLC 参考值的相关图Fig.4 Correlation between NIR predicted and reference values for specnuezhenide

2.5 定量模型的验证

图5 特女贞苷NIR 预测值与HPLC 参考值的偏差图Fig.5 Deviation between NIR predicted and reference values for specnuezhenide

为评价模型的实际预测效果，将20 份验证集样品的近红外光谱输入所建定量模型中，预测其特女贞苷的含量，结果见表5。验证集的最大绝对误差为0.35%，最小绝对误差为0.00%，相对误差均不超过5.83%，平均相对误差为2.83%。由此可见NIR 预测值与HPLC 参考值非常接近，该定量分析模型准确可靠，预测能力较好，可以准确预测相应范围内女贞子药材中特女贞苷的含量。

表5 20 份验证集样品的近红外定量模型预测值Table 5 NIR predicted values of 20 validation set

3 讨论

本实验采用2010 年版《中国药典》一部中女贞子项下特女贞苷的HPLC 含量测定方法进行测定，并对每份样品平行重复测定2 次，取2 次测定结果的平均值作为建立近红外定量分析模型的NIR 参考值，可以保证所建模型的准确性。

近红外定量分析模型的适用范围取决于校正集样品指标性成分的含量范围。本实验收集到的女贞子药材来自浙江、湖南、河南、四川等多个产地，涵盖范围较广且分布较为均匀，具有一定的代表性。因此，所建模型适用性较强，可用于女贞子药材中指标性成分特女贞苷的含量预测。

本实验运用近红外光谱技术结合偏最小二乘法建立了一种快速测定女贞子药材中特女贞苷含量的新方法，该方法简单准确，快速无污染。相比2010年版《中国药典》中规定采用高效液相色谱法对女贞子中特女贞苷进行含量测定，虽然HPLC 的测定结果较准确，但是其前处理繁琐复杂，且化学试剂污染空气环境，测定过程较长。反观近红外光谱技术，分析速度快，获得信息多，简便快捷，非破坏性分析等优点使其成为一种“绿色”分析技术，测定过程不用化学试剂、不污染环境，真正实现“绿色”检验，节约检测成本，将会在中药制药行业发挥越来越大的作用。

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