玄参饮片质量控制方法研究

贾成友，张传辉，赵凤平，傅 亚，王云红*，杨荣平*

1 成都中医药大学药学院，成都 611137;2 重庆市中药研究院，重庆 400065;3重庆科技学院化学化工学院，重庆 401331

玄参系玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根，具有凉血滋阴、泻火解毒的功效，主产于浙江、四川、湖北、安徽、江苏等地。玄参药用历史悠久，栽培地区广泛，具有多种类型的种质［1］，且炮制方法多样，具有净制、切制、单纯加热制、辅料制等［2］。2010 年版《中国药典》(一部)规定玄参饮片中哈巴苷和哈巴俄苷的总量不得少于0.45%［3］，鉴于中药成分的复杂性，多指标成分同时测定也并非能将所有活性成分定量。因此，本研究在测定16批重庆市售玄参饮片中哈巴苷和哈巴俄苷含量的基础上，对其合格者进行了指纹图谱研究［4-7］，并采用聚类分析(Cluster analysis)、主成分分析(Principal component analysis)等方法［8-10］探究重庆市售玄参饮片质量情况，以期为玄参饮片质量控制和标准提升提供更好的技术手段和科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

20A 系列HPLC 仪(配备二元泵，在线脱气，DAD 检测器，自动进样器，柱温箱，日本岛津公司)，CPA 225D 型电子天平(十万分之一，德国Sartorius公司)，BS 224S 型电子天平(万分之一，德国Sartorius 公司)，DHG-9240A 型电热恒温鼓风干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司)。

哈巴苷(批号FY12871128)、哈巴俄苷(批号FY12861116)对照品购自南通飞宇生物科技有限公司，肉桂酸(批号110786-200503)对照品购自中国药品生物制品检定所，所有对照品经HPLC 峰面积归一化法检测纯度均高于98%，乙腈、甲醇均为色谱纯，磷酸、冰醋酸为分析纯，水为自制超纯水。

1.2 样品来源

玄参饮片购于重庆桐君阁中药批发商及桐君阁药房、万鑫药房、和平药房、康济大药房等各大药店，经重庆市中药研究院李隆云研究员鉴定为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根。

1.3 实验方法

1.3.1 一测多评法测定肉桂酸、哈巴苷和哈巴俄苷的含量

1.3.1.1 色谱条件

色谱柱:Inertsustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相:0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，0～10 min，3%B;10～20 min，3%～22%B;20～60 min，22%B;60～70 min，22%～3%B，进样量10 μL，流速0.8 mL/min，检测波长210 nm，柱温35℃。

1.3.1.2 对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥10 h 的肉桂酸、哈巴俄苷和哈巴苷对照品适量，加30%甲醇制成每1 mL 含肉桂酸4.098 μg、哈巴俄苷9.6 μg、和哈巴苷58.2 μg 的混合对照品溶液，即得。

1.3.1.3 供试品溶液的制备

取玄参药材粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定重量，浸泡1 h，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)45 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

笔者在前期研究中已建立采用HPLC 法同时测定玄参药材及饮片中哈巴苷和哈巴俄苷含量的一测多评评价模式［11］，鉴于已另文发表，这里仅作简要阐述:以肉桂酸为内标物质，按照公式fs/k=fs/fk=(Cs×Ak)/(Ck×As)(式中CS为内标物浓度，AS为内标物峰面积，Ck为待测成分对照品k 的浓度，Ak为待测成分对照品k 的峰面积)计算得到肉桂酸对哈巴苷和哈巴俄苷的校正因子(RCF)分别为f肉桂酸/哈巴苷=0.0607，f肉桂酸/哈巴俄苷=0.3040。精密吸取肉桂酸系列浓度对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品质量(X，μg)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=6465700X-4021.3(r=0.9999)，线性范围0.008196～0.122940 μg，结果表明，肉桂酸在相应范围内线性关系良好。

1.3.2 玄参饮片指纹图谱分析

1.3.2.1 色谱条件

色谱柱:Inertsustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:1%冰醋酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱，0～20 min，5%～30%B;20～40 min，30%～45%B;40～50 min，45%～65%B;50～60 min，65%～100%B;进样量10 μL，检测波长290 nm，流速1 mL/min，柱温30 ℃。

1.3.2.2 对照品溶液的制备

对照品溶液的制备方法同“1.3.1.2”。

1.3.2.3 供试品溶液的制备

取玄参药材粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，密塞，称定重量，浸泡1 h，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)60 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.3.2.4 精密度试验

精密吸取同一份供试品溶液10 μL，连续进样6次，依法测定，记录峰面积。结果以肉桂酸峰的保留时间和峰面积为对照，各共有峰的相对保留时间和峰面积比值基本一致，其RSD 均小于3.0%，相似度均在0.99 以上，符合指纹图谱技术的要求，表明仪器精密度良好。

1.3.2.5 稳定性试验

分别于0、4、8、12、24、36 h，精密吸取同一份供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，依法测定，记录峰面积。结果以肉桂酸峰的保留时间和峰面积为对照，各共有峰的相对保留时间和峰面积比值基本一致，其RSD 均小于3.0%，相似度均在0.99 以上，符合指纹图谱技术的要求，表明供试品溶液在36 h 内稳定。

1.3.2.6 重复性试验

取同一批次的玄参药材粉末(过三号筛)6 份，每份约0.5 g，依法制备供试品溶液，分别进行测定，记录峰面积。结果以肉桂酸峰的保留时间和峰面积为对照，各共有峰的相对保留时间和峰面积比值基本一致，其RSD 均小于3.0%，相似度均在0.99 以上，符合指纹图谱技术的要求，表明本方法稳定，可靠，具有较好的重复性。

1.3.2.7 耐用性试验

分别考察一定范围内流动相梯度、柱温、检测波长、流速变化，以及采用3 根不同的色谱柱Inertsustain C18、Waters C18、Diamonsil C18(均为4.6 mm×250 mm，5 μm)进行测定对仪器色谱行为变化的影响，结果各条件下所测各主要色谱峰相对保留时间RSD 在0.812%～2.671%之间，相对峰面积比值RSD 在0.99%～2.74%之间，表明本方法具有较好的耐用性。

1.3.3 聚类分析［8］

根据指纹图谱分析结果，将筛选出的11 批玄参饮片主要共有峰面积导入SPSS 19.0 软件，采用欧式距离平方、组间平均连接法对11 批饮片进行聚类分析。

1.3.4 主成分分析［9，10］

将11 批重庆市售玄参饮片指纹图谱中所确定的主要共有峰面积导入SPSS 19.0 软件，依法分析，取特征值较为明显的两个组成分(方差贡献率≥60%)的得分做向量图，进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 16 批玄参饮片中肉桂酸、哈巴苷和哈巴俄苷的含量测定

采用所建立的一测多评法对所购16 批玄参饮片中哈巴苷和哈巴俄苷含量进行测定，结果见表1。

表1 玄参饮片中哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷含量Table 1 The contents of harpagide，cinnamic acid and harpagoside in R.scrophulariae pieces

由表1 可知，16 批玄参饮片中只有11 批满足2010 年版《中国药典》(一部)玄参饮片含量测定项下要求，将合格饮片依次标为S1～S11 表示。可见，合格饮片中哈巴苷、肉桂酸和哈巴俄苷含量均高于不合格者，表明通过指标成分控制饮片质量具有一定的可行性。但合格玄参饮片中哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷含量及哈巴苷哈巴俄苷总含量的RSD 分别为34.22%、52.42%、47.53%、13.41%，表明不同饮片间哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷含量的RSD 差异较大，仅通过指标成分的方法控制药材的质量具有一定的局限性，并非可以反映所有活性成分的信息。

因此，研究拟将一测多评含量测定技术相和指纹图谱技术相结合，用于玄参饮片质量控制和评价，旨在进一步探索玄参质量标准提升的科学方法。

图1 玄参饮片HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints for 11 batches of R.scrophulariae pieces

2.2 玄参的指纹图谱分析

2.2.1 指纹图谱的建立及相似度评价

按照所建立的方法，以肉桂酸为参照物，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A 版(国家药典委员会)软件对11 批合格玄参饮片进行指纹图谱测定，所得HPLC 指纹图谱及生成的玄参饮片对照指纹图谱见图1、图2，相似度计算结果见表2。

图2 玄参饮片对照指纹图谱Fig.2 Typical fingerprint of R.scrophulariae pieces

表2 相似度计算结果Table 2 Results of Similarity calculation

2.2.2 共有特征峰的标定与色谱峰归属

对各批饮片进行特征图谱分析，共标定了53 个共有峰，确定了18 个主要共有指纹峰，峰面积结果见表3。指定了其中7 个指纹图谱共有峰，并对1、5、7 号色谱峰进行指认，分别为哈巴苷，肉桂酸和哈巴俄苷。

表3 玄参饮片指纹图谱共有峰峰面积Table 3 Peak area of common peaks in fingerprint of R.scrophulariae pieces

经指纹图谱分析发现，11 批玄参饮片相似度在0.731～0.960 之间，除S11 相似度为0.731 外，其余10 批次饮片整体上具有良好的相似性。然而，18个主要共有峰面积RSD 在12.5%～107.5%之间，非共有峰面积的比例在21.7%～41.4%之间，表明不同批次玄参饮片的化学成分种类和含量均存在一定的差异性，药材质量参差不齐，仅仅利用相似度及峰面积RSD 等方法无法全面客观地体现饮片之间存在的差异性和一致性。因此，拟采用CA 和PCA相结合的方法对11 批饮片进行共有模式识别研究。

2.3 聚类结果分析

采用上文方法，将18 个主要共有峰面积导入SPSS 19.0 软件进行聚类分析，结果如图3 所示。

图3 聚类分析结果Fig.3 Results of cluster analysis

由图3 可知，以α 线为界，饮片可聚类为3 类:I(S1、S10、S2、S8、S3、S5)，II(S4、S6、S9、S7)，III(S11)。其中，S1、S10、S2 与S8 聚为一类后又与S3、S5 聚为一类，表明饮片S1、S10、S2、S8、S3、S5 之间具有一定的统一性;I 类中，S1、S10、S2 聚为一类，S3、S5 聚为一类，S8 单独聚为一类，表明同一类别中饮片又存在一定的差异性。同样，S4、S6 与S9聚为一类后又与S7 聚为一类形成II，说明它们之间既有一定的统一性又存在一定的差异性。以β 线为界，饮片可聚类为2 类，S11 被单独的分为一类(产地为浙江，其他饮片均来自川渝地区)，其余样品被聚为另一类。根据前文计算结果，S11 中哈巴苷与哈巴俄苷总含量为0.549%，高于S1、S2、S7、S8、S10，但与对照指纹图谱比较相似度为仅为0.731，表明通过指标成分控制药材质量具有局限性，不同产地的饮片之间存在着较大的地域性差异，聚类分析对玄参进行化学模式识别具有一定的科学道理。

2.4 主成分结果分析

采用上文方法，将18 个主要共有峰面积导入SPSS 19.0 软件，取特征值较为明显的两个组成分(方差贡献率63.62%)的得分做向量图，结果如图3 所示。

图4 主成分分析结果Fig.4 Results of principal component analysis

由图4 可知，11 批饮片相对集中地分散于3 个部分，S4、S6、S7、S9 集中于a 部分，S1、S2、S3、S5、S8、S10 集中于b 部分，S11 远离其它批次集中于c部分。a、b、c 之间相对偏离较大，表明彼此之间成分差异性较大，该分析结果与聚类分析结果具有一致性。其中，a 部分4 个点分布较为离散，表明对应4 个批次的饮片间存在着一定的差异性;b 部分又可以相对地分为两部分:S10 与S1 极为接近，表明对应的饮片具有显著地相似性，S2、S3、S5、S8 同样具有一定的相似性，表明S10 与S1 之间，S2、S3 与S5、S8 饮片之间成分较为接近，但是每一点之间又相对离散，说明各饮片之间存在一定的差异性;S11 因哈巴苷与哈巴俄苷总含量较高而单独归为一类。可知，主成分分析在一定程度上反映了玄参饮片之间存在的统一性及差异性，与聚类分析吻合性较好。

3 结论

重庆市售16 批玄参饮片中只有11 批饮含量符合2010 年版《中国药典》规定，合格率仅为68.75%，说明目前药材市场上玄参饮片质量参差不齐。笔者经过文献调研发现影响玄参质量的因素有很多，归纳起来主要有:玄参药材生产过程中缺少质量管理规范，不能从源头上控制中药饮片质量，导致药材不能达到“真实、优质、稳定、可控”的标准;中药材市场经营缺乏规范化管理，一些不法商贩为牟取暴利以假掺杂或以次充好;玄参成分复杂，成分相互之间会发生很多化学反应，外界条件稍有变化，即可能造成其成分存在明显差异;玄参系大宗药材，经常与其他药材混合存储，储存条件落后且重庆地区多高温高湿天气，易于产生虫害和霉变而影响药材质量。以上种种皆可归根于生产缺少规范化标准，如饮片在炮制中可能存在炮制不规范、质量标准不统一等问题，笔者呼吁相关部门加大对玄参饮片炮制、质量检验地规范化管理。

一测多评法作为一种全新的多指标质量评价模式，实现了在对照品缺失的情况下，完成多指标成分定量，达到真正对中药内在质量进行有效表征、综合评价和全面控制的目的，对于中药的质量控制和评价模式具有重要作用。本研究在一测多评测定玄参饮片多指标成分含量的基础上，建立了玄参饮片的指纹图谱，并结合聚类分析、主成分分析方法对玄参的质量进行综合全面地评价，为玄参饮片质量的控制和评价提供更好的技术参考，为玄参饮片质量标准的提高研究提供了科学依据。

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