石花菜醇提物对小鼠高尿酸血症的拮抗效应

肖 为，陶叶杏，谷毅鹏，陈秋扬，贝泽祈，张大艳，刘华忠

1 广东海洋大学食品科技学院;2 广东海洋大学理学院，湛江 524088

尿酸是体内嘌呤代谢的最终产物，当代谢过程发生紊乱时便有可能引发高尿酸血症［1］。高尿酸可诱发多种疾病，如痛风性关节炎、痛风性肾病、尿酸结石甚至尿毒症［2］等。目前，用于治疗高尿酸血症的化学药品主要包括黄嘿呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇和促尿酸排泄药物丙磺舒、苯溴马隆［3，4］等，不仅种类有限且对机体毒副作用较大。目前报道能够降低血清中尿酸的天然药物主要有茶树根、芒果苷、迷迭香、秦皮等［5-8］，而石花菜醇提物的降尿酸功效笔者尚未见文献报道。

石花菜(Gelidium amansii)别名鸡毛菜、草珊瑚、海冬菜等，属于红藻门石花菜科。为中国黄海、渤海、东海常见种类，供食用，也是提取琼胶的主要原料［9］。琼胶的用途十分广泛，主要可作为微生物培养基，用于水产、医药、酿造以及很多生物学部门研究开发［10］。孙杰［11］等对石花菜醇提取物的化学成分检测分析发现其含有多种活性成分，如糖类、生物碱等，均具有一定的生理和药理活性。本文主要研究不同剂量石花菜醇提物对氧嗪酸钾盐诱导小鼠高尿酸血症的拮抗作用，为进一步开发和利用石花菜防治高尿酸血症提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF 级性成熟的昆明雄性小鼠，生产许可证号:SCXK 桂2009-0002，8 周龄共60 只(24.11±3.05 g)，购自广西医科大学实验动物中心;石花菜(经广东海洋大学水产学院谢恩义教授鉴定)采自广东湛江硇洲岛。

尿酸(UA)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、腺苷脱氨酶(ADA)、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(货号依次为:C012、C011-1、C013-1、A002、A048、A045-2)，南京建成生物工程研究所;别嘌呤醇，美国Sigma-Aldrich 公司;羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，天津市致远化学试剂有限公司;氧嗪酸钾盐，Aidrieh Chemical Company，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器

MP200A 型电子天平，上海精科天平;GZX-9140 MBE 型电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司SHZ-DⅢ真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司;90-1 型台式低速离心机，上海手术器械厂;7200 型分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司;BX51 型多功能显微镜;UC7 型超薄切片机，德国莱卡。

1.3 方法

1.3.1 石花菜醇提物制备［12］

新鲜石花菜样品采集后，除去附生生物，淡水冲净后冷冻保存。用前取出解冻，滤纸拭干藻体。取干燥藻体称量后用剪刀剪碎。将石花菜按1∶14 的料液比加入50%的乙醇溶液浸泡，在室温下放置3 d，最后抽滤即得石花菜醇提物。

1.3.2 实验动物分组与处理

将60 只小鼠适应饲养一周后，随机分为6 组，即空白组(A)、模型组(B)、阳性对照组(C)、治疗组1(D)、治疗组2(E)、治疗组3(F)，每组10 只。将别嘌呤醇混悬于浓度0.8% CMC-Na 中，阳性对照组灌胃该混悬液剂量为40 mg/(kg·d)［13］。通过前期灌胃不同剂量石花菜醇提物的预实验分析可知，3 个治疗组可分别设置灌胃石花菜醇提物剂量为低剂量0.3 mg/(kg·d)、中剂量0.6 mg/(kg·d)、高剂量1.0 mg/(kg·d)。严格控制饲养环境(温度22±2 ℃，湿度55±5%，光照12 h)自由摄入水和饲料。各组实验动物均连续处理8 d，正常给水、喂食及饲养。

1.3.3 高尿酸血症小鼠模型的建立［14］

采用氧嗪酸钾盐抑制尿酸分解的方法建立小鼠高尿酸模型。氧嗪酸钾盐用灭菌蒸馏水配制成混悬液(250 mg/kg)，每天在正常给药前1 h，除正常组灌胃一定量生理盐水，其余各组分别灌胃等量氧嗪酸钾盐混悬液。药物治疗组在开始灌胃氧嗪酸钾盐时，每天对相应组别小鼠进行治疗药物灌胃，实验分组及药物处理如表1 所示。

表1 实验动物分组及药物处理Table 1 The grouping and drug treatment of the experimental animals

1.3.4 病理学观察

药物处理8 d 后，脱颈椎处死小鼠，取小鼠肾脏，用预冷生理盐水进行清洗并称重，然后将一侧肾脏于10%中性甲醛溶液中固定24 h，脱水石蜡包埋，以4～5 μm 厚度连续切片，置于干净载玻片后，用苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察病理变化。

1.3.5 血清尿酸(UA)水平测定

药物处理8 d 后，摘取眼球取血，采用磷钨酸法测定血清尿酸水平。无蛋白滤液中尿酸在碱性状态下还原磷钨酸生成钨蓝、尿囊素和二氧化碳，蓝色深浅与尿酸浓度成正比。检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.6 血清肌酐(Cr)水平测定

药物处理8 d 后，摘取眼球取血，利用除蛋白的血清中肌酐与苦味酸产生Jaffe 反应生成桔红色加成物进行测定。检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.7 血清尿素氮(BUN)水平测定

药物处理8 d 后，摘取眼球取血，尿素氮水解生成NH3和CO2，其中NH3与指示剂发生反应引起颜色变化，利用分光光度法检测可得。检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.8 肝脏黄嘌呤氧化酶(XOD)活性测定

药物处理8 d 后，脱颈椎处死小鼠，取小鼠肝脏制匀浆液，肝脏中的XOD 可催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，且产生超氧阴离子自由基，在显色剂和电子受体同时存在时，可生成红紫色结合物，根据生成量多少检测XOD 活力。检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.9 肝脏腺苷脱氨酶(ADA)活性测定

药物处理8 d 后，脱颈椎处死小鼠，取小鼠肝脏制匀浆液，肝脏中的ADA 可催化腺嘌呤核苷水解，产生次黄嘌呤核苷和氨，再对产生的氨显色，便可根据OD 值计算ADA 活性。检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.10 统计学处理

使用SPSS 19.0 统计软件对所有试验数据进行分析和处理。不同处理间差异，采用t 检验和单因素方差分析进行比较，以P＜0.05 为具有显著性。结果用“x±S”表示。

2 结果与分析

2.1 病理学观察

由图1 肾脏病理学图片分析可知，正常组中肾组织结构正常，肾间质含量丰富，肾小球数量较多，且相互间隔较均匀，大小正常。模型组中肾小球萎缩变形，数目明显较正常组减少。阳性对照组及各石花菜醇提物治疗组肾小球的结构恢复正常、数目也较模型组明显增多，肾小球萎缩现象有一定程度缓解，尤其是阳性对照组C 及治疗组F，肾小球数目较模型组增多较为显著。

2.2 血清尿酸水平比较

一般认为血清尿酸≥70.58 g/L(416 μmol/L)时为高尿酸血症［13］，比较可知模型组血尿酸含量大于此高尿酸血症最低值造模成功。由表2 可知，与空白组相比，模型组小鼠尿酸水平显著升高(P＜0.01)，阳性对照组与治疗组F 均无统计学差异。与模型组相比，阳性对照组和各药物治疗组小鼠血清尿酸水平均显著降低(P＜0.01)。说明石花菜醇提物能明显降低血清尿酸水平，其中治疗组F 效果较其他药物组尤其明显，并与空白组指标最为接近。

图1 石花菜醇提取物对肾脏组织病理学变化的影响Fig.1 Effect of G.amansii alcohol extract on kidney tissue pathological change

表2 石花菜醇提取物对小鼠血清尿酸水平的影响Table 2 Effect of G.amansii alcohol extract on serum uric acid levels in mouse

2.3 血清肌酐与尿素氮水平比较

表3 石花菜醇提取物对小鼠血清肌酐、尿素氮水平的影响Table 3 Effect of G.amansii alcohol extract on Cr and BUN level in mouse

由表3 可知，与空白组相比，模型组小鼠肌酐与尿素氮水平均显著升高(P＜0.01)，治疗组E 的肌酐水平升高，其他各组小鼠的肌酐与尿素氮水平均无统计学差异。与模型组相比，阳性对照组与各药物治疗组在小鼠肌酐与尿素氮水平上均显著降低(P＜0.01)，其中，肌酐与尿素氮水平均为治疗组F与空白组最为接近。说明，石花菜醇提物能显著的降低高尿酸血症小鼠血清中肌酐与尿素氮水平，其中，均为治疗组F 效果较其他药物组尤为显著。

2.4 肝脏XOD 及ADA 活性比较

表4 石花菜醇提取物对小鼠肝脏XOD 及ADA 活性的影响Table 4 Effect of G.amansii alcohol extract on the XOD and ADA activities in mouse liver

由表4 可知，与空白组相比，模型组小鼠肝脏ADA 的活性升高(P＜0.05)，且XOD 活性显著升高(P＜0.01)，而阳性对照组和各药物治疗组小鼠的肝脏中ADA 与XOD 活性均无统计学差异。与模型组相比，阳性对照组与各药物治疗组小鼠肝脏XOD活性显著降低(P＜0.01)，而ADA 活性无统计学差异。结果表明，石花菜醇提物能一定程度上恢复氧嗪酸钾盐致小鼠肝脏XOD 水平的异常。

3 讨论

现在普遍认为，高尿酸血症与代谢综合征有十分紧密的联系，而临床药物治疗高尿酸血症主要采取促尿酸代谢和抑制尿酸在体内生成为主。目前，促尿酸排泄的药物苯溴马隆和抑制体内尿酸合成的别嘌呤醇，均存在一定的不良反应，如造血功能异常、肝肾功能障碍、痛风发作等使它们在临床应用上受到一定限制［15］。所以探索具有促进体内尿酸排泄和抑制体内尿酸合成双重作用的天然药物对于治疗高尿酸血症有重要意义。古代医药典籍记载，石花菜味甘咸，性寒，全藻入药能消热解毒、缓泻，有利便利尿之功效，可用于治疗肾盂、肾炎等症状。现代研究表明，石花菜所含的褐藻酸盐类物质有一定的降血压作用，所含多糖类物质淀粉类硫酸脂具有降脂功能，对高血压、高血脂也有一定的防治作用［16］。基于此，本实验首次选用石花菜为研究对象，对其醇提物对高尿酸血症小鼠的拮抗效应进行研究。

根据本实验结果分析可知，与模型组相比，各药物组小鼠血清中尿酸(UA)、肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平均极显著降低(P＜0.01)，且以1.0 g/kg 的药物组F 效果尤为明显，同时，肌酐和尿素氮水平也是间接反应肾功能的重要指标［17］，表明石花菜醇提物可一定程度上保护肾功能，对于促进尿酸在体内的代谢有十分积极的作用。

肝脏中的XOD、ADA 均为体内尿酸合成中的关键性酶，在尿酸合成过程中发挥极其重要的作用，当肝脏中的XOD、ADA 活性升高时，可促进体内核酸分解代谢，其可将次黄嘌呤、黄嘌呤氧化生成尿酸，从而影响尿酸水平使其升高［18］，目前，XOD、ADA作为尿酸生成的关键酶，其抑制剂的研究是抗高尿酸血症和痛风药物开发的重点。由本实验分析可知，与模型组相比，各药物治疗组虽然对于小鼠肝脏ADA 活性无统计学差异(P＞0.05)，但石花菜醇提物能一定程度上缓解氧嗪酸钾盐致小鼠肝脏XOD水平的异常，对XOD 活性可显著降低(P＜0.01)。说明石花菜醇提物对于抑制尿酸在体内的合成有一定的积极意义。

本文研究结果表明，石花菜醇提物能明显降低模型小鼠血清中的尿酸、肌酐与尿素氮水平，并且可以通过抑制肝脏内XOD 的活性，缓解高尿酸所致的肝、肾功能损伤，且综合实验数据以1.0 g/kg 的石花菜醇提物的效果最佳。石花菜醇提物对小鼠高尿酸血症的治疗作用主要通过降低血清中尿酸、肌酐和尿素氮水平促进排泄，且可降低肝脏中XOD 活性，一定程度上抑制尿酸在体内的合成，但其具体机制尚不清楚。

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