不同促渗剂对雷公藤红素醇质体体外透皮吸收的研究

吴 军，刘 荻，马 卓

（湖北工业大学 轻工学部，湖北 武汉430068）

雷公藤是一味常用中药材，具有杀虫止血、舒筋活血、祛风通络、清热解毒、消肿止痛等功效［1］。但根据国家药品不良反应监测中心2004－2011年的报告显示，雷公藤制剂在治疗疾病的同时也伴随着严重的肝毒性、肾毒性、生殖毒性及皮肤毒性［2］，因此，亟需进一步研究雷公藤的治病机制，以便降低其毒副作用。现阶段对雷公藤的研究主要集中在雷公藤红素的治病机理上。雷公藤红素（Celastrol，Cel），是一种三萜类化学成分［3］（结构式见图1），具有抑制免疫反应和抗炎的作用［4－5］，但其难溶于水、口服吸收差及毒性较大限制了它的临床应用。醇质体具有较高的双分子层流动性、易于变形及可穿透皮肤屏障等优点［6］，故本试验以醇质体为载体，考察不同促渗剂对Cel醇质体体外透皮吸收的影响，筛选出最佳促渗剂。

图1 雷公藤红素的化学结构

1 试验材料

1.1 仪器

CAV214C电子天平，奥豪斯国际贸易有限公司；U-3000高效液相色谱仪，戴安；TP2A型智能透皮试验仪，巩义市英峪予华仪器厂（扩散池参数:扩散面积1.77cm2，接受池容积18mL）；QL-901旋涡混合器，江苏海门市麒麟医用仪器厂；KQ-300TDB型高频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试药

Cel、Cel对照品，中科院武汉植物园，批号20130524；丙二醇、甘油，国家集团化学试剂有限公司，批号20121019；薄荷脑，南通薄荷厂，批号20140101；水溶性氮酮，武汉金信达医药辅料技术开发有限公司，批号20140702；甲醇，色谱纯；乙醇、冰醋酸，均为分析纯；吐温80，国药集团化学试剂有限公司，批号20121225；超纯水；磷酸盐缓冲液，PBS，pH＝7.4，实验室自制。

1.3 实验对象

昆明种雄性小鼠（SPF级，体重18～22g），湖北省实验动物研究中心提供，许可证号:SCXK（鄂）2008－0005。

2 方法与结果

2.1 Cel醇质体的制备

采用乙醇注入法制备醇质体［7］。精密称取一定量Cel、蛋黄卵磷脂、胆固醇于小烧杯中，加入无水乙醇，密封，50℃恒温水浴使其溶解，构成有机相；另取一定量超纯水加入平底烧瓶中，置于磁力搅拌器（700r/min）上，构成水相。将另取26mL超纯水加入平底烧瓶中，置于磁力搅拌器，搅拌速度为700r/min，搅拌温度50℃，构成水相。在密闭条件下用注射器将有机相缓慢加入到水相中，继续搅拌2h，自然冷却后超声30min，将所得混悬液用0.45μm孔径有机系滤膜过滤，即得。

2.2 含量测定方法

2.2.1 色谱条件 Agilgent HC-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱温35℃；流动相为V（甲醇）∶V（1%冰醋酸）＝90∶10；检测波长425nm；流速为1mL/min；进样量20μm。Cel对照品、含药接收液及空白接受液的HPLC色谱图见图2，空白接收液成分对样品测定没有干扰，表明上述色谱条件可行。

图2 HPLC色谱图

2.2.2 标准曲线的制备 精密称取Cel对照品10 mg，置于100mL量瓶中，无水乙醇定容，得到浓度为100μg/mL的Cel储备液。精密吸取上述储备液1、2、4、5、6、8mL分别于10mL量瓶中，无水乙醇定容，得到浓度为10.0、20.0、40.0、50.0、60.0、80.0、100.0μg/mL的一系列标准溶液，以峰面积（A）和质量体积（C）分别为纵坐标、横坐标，绘制标准曲线，所得线性回归方程为A＝0.5054C－0.0479（r＝0.9998），表明 Cel浓度在10.0～100.0 μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

图3 雷公藤红素的标准曲线

2.2.3 精密度实验 取“2.2.2”项下10.0、50.0、100.0μg/mL的标准溶液，于1d内连续进样5次，计算日内精密度；不同天内，每日进样1次，连续进样5d，计算日间精密度。日内RSD分别为1.3%、1.1%、0.6%，日间 RSD 分别为 2.3%、1.6%、0.9%，结果日内及日间精密度的RSD均在《中华人民共和国药典》（2010版）二部附录Ⅺ ⅩA的要求范围内，说明日内及日间精密度良好。

2.2.4 稳定性考察 精密吸取1mL雷公藤红素醇质体液，置于10mL容量瓶，甲醇定容，超声15 min破乳，分别于0、2、4、6、8、12、24h进行测样，计算RSD。结果RSD为1.1%，表明Cel标准溶液在24h内稳定。

2.3 体外透皮试验

2.3.1 离体小鼠皮肤的制备 取18～22g的健康昆明小鼠，用脱毛剂（8%硫化钠浆糊:硫化钠8g，淀粉7g，糖4g，甘油5g，硼砂1g，加水75mL搅拌均匀）脱去小鼠腹部毛发，边脱边洗，放置过夜，第二天短颈处死小鼠，剥取皮肤，除去皮下组织和脂肪，生理盐水漂洗干净后即用。

2.3.2 透皮吸收实验［8］将离体小鼠皮肤固定在给药池与接受池之间，接受液液面与皮肤真皮层面接触；给药池分别注入Cel醇质体、空白醇质体/Cel溶液和Cel溶液2mL，接受池中分别加入18mL透皮接受液（20%乙醇，0.5%聚山梨酯-80的 PBS液），液体恒速搅拌（400r/min），并保持恒温37℃（±0.1℃），分别于2，4，6，8，10，12，24，48h取1 mL接受液，及时用移液枪补充同温同体积的新鲜接受液。将取得的样品用0.22μm的有机微孔滤膜滤过，进样检测，累积渗透量和渗透速率计算公式

渗透速率

式中:Cn为不同取样点时的接受液的浓度；Ci为各取样点时取样液的浓度；V，Vi分别为接受池体积和取样体积；A 为透皮扩散面积（1.77cm2）；Δt为取样点的时间间隔。

2.3.3 接收液的选择 选择透皮接受液的原则是使药物被机体吸收的环境达到“漏槽条件”，即药物在接受液中的累积渗透量要较大。实验中分别配制生理盐水，V（乙醇）∶V（PEG400）∶V（生理盐水）＝5∶2∶3，V（乙醇）∶V（TW80）∶V（PBS）＝20∶0.5∶80）及V （乙醇）∶V （PBS）＝20∶80）这四种接受液，分别测定48h时Cel醇质体在这4种接收液中的累积渗透量。其透皮结果见表1。结果表明，Cel醇质体在乙醇/TW80/PBS中的累积渗透量最大，为77.01μg/cm2，故选择乙醇/TW80/PBS为接受液。分别如下:

累积渗透量

表1 不同接收液中48 h后Cel醇质体的累积渗透量与累积透过率（n＝3）

2.3.4 不同促渗剂对Cel醇质体透皮吸收的影响

根据相关文献的查阅和前期考察，本实验选择了几种常用的促渗剂:丙二醇、甘油、氮酮及薄荷脑，同时考虑到促渗剂的刺激性问题，将丙二醇、甘油、氮酮及薄荷脑的考察范围分别设定为5%～15%、1%～5%、1%～3%及0.5%～1.5%，按“2.3.3”项下方法进行实验，考察不同促渗剂对Cel醇质体体外透皮吸收的影响，实验结果（表2）表明不同的促渗剂对Cel醇质体透皮吸收有不同的影响:当加入薄荷脑和甘油后，Cel醇质体的渗透速率减小了；而丙二醇和氮酮能促进Cel醇质体的透皮吸收，其中，丙二醇的促渗效果最明显，且渗透速率随着丙二醇含量的增加而增加，当丙二醇的含量为15%时，促渗作用最大，增渗倍数为1.26倍。

表2 不同促渗剂对Cel醇质体体外透皮吸收的影响（n＝3）

3 讨论与结论

将Cel制备成醇质体，以便将来可能作为搽剂来治疗风湿性关节炎或红斑狼疮等自身免疫性疾病，其中累积透过量和渗透速率是判断一种药物是否能达到疗效的重要指标。根据透皮实验结果，薄荷脑和甘油不利于Cel醇质体的透皮吸收，可能是由于薄荷脑和甘油的加入导致了醇质体双分子层结构的破坏，引起了药物渗漏。丙二醇的作用机制主要是通过在角质层蓄积，增加药物在角质层中的溶解性和分配性，从而起到促渗作用。因此可考虑丙二醇作为Cel醇质体的促渗剂。

［1］ 黄明来，马 卓.雷公藤的研究进展［J］.化学与生物工程，2012，29（07）:1-4.

［2］ 周炎仪，黄捷仪，李静玲，等.雷公藤制剂的用药安全性分析［J］.临床合理用药杂志，2012，5（23）:120.

［3］ Yuanqiang Guo，Xian Li，Jinghui Wang，et al.A new alkaloid from the roots of Celastrus orbiculatus ［J］.Fitoterapia，2005，76（02）:273-275.

［4］ Allison AC，Cacabelos R，Lombardi VR，et al.Celastrol，apotent antioxidant and anti-inflammatory drug，as a possible treatment for Alzheimer′s disease［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2001，25（07），1 341-1 357.

［5］ Pinna GF，Fiorucci M，Reimund JM，et al.Celastrol inhibits pro-inflammatory cytokine secretion in Crohn′s disease biopsies［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，322（03）:778-786.

［6］ Godin B，Touitou E，Rubinstein E，et al.A new approach for treatment of deep skin infections by an ethosomal antibiotic preparation:an in vivo study［J］.J Antimicrob Chemother，2005，55（06）:989-994.

［7］ Touitou E，Dayan N，Bergelson L，et al.Ethosomes-novel vesicular carriers for enhanced delivery:characterization and skin penetration properties［J］.J Control Release，2000，65（03）:403–418.

［8］ 罗丽萍，王 军，何 文.酮洛芬醇质体体外经皮渗透研究［J］.中国药师，2012，15（09）:1 225-1 227.