酿酒酵母培养基及发酵条件的优化研究

■宋志元 刘 建 刘三侠 储 君 张要齐

（河南惠通天下动物药业有限公司，河南郑州 450008）

随着抗生素饲料添加剂广泛使用，人们也逐渐认识到抗生素带来的弊端，并呼吁开发绿色饲料添加剂替代抗生素。因此，世界各国对新型绿色饲料添加剂的研究与应用十分重视[1]，其中，微生态制剂是目前研究和应用的热点和焦点。微生态制剂通过维持肠道内微生态平衡[2]、产生有益代谢物[3]而发挥作用，具有防治疾病、增强机体免疫力、促进生长、增加体重等多种功能，且无污染、无残留、不产生抗药性，可作为抗生素的替代品应用于饲料添加剂中。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是单细胞微生物，属于真菌类，耐酸性强[4]。活性干酵母、酵母培养物、酵母提取物、酵母细胞壁等都是我国农业部《饲料添加剂品种目录》(2008)所允许使用的饲料添加剂。本文对酿酒酵母液体发酵工艺进行优化，以期提高酿酒酵母的产量，为以后规模化生产提供技术支撑。

1 材料

1.1 菌种

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，河南惠通天下动物药业有限公司微生物实验室分离并保存。

1.2 培养基

改良马丁氏培养基：葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、K2HPO40.1%、MgSO40.05%，pH值6.0。检测培养基为种子培养基中加1.5%琼脂粉。

基础发酵培养基：葡萄糖5%、蛋白胨2%、KH2PO40.1%、K2HPO41.0%、MgSO4·7H2O 0.1%、NaCl 0.1%。

2 方法

2.1 酿酒酵母生长曲线的绘制

将斜面菌种或种子液接种至培养基中，振荡速率为150 r/min，30℃振荡培养。从接种后0 h开始，每2 h取一次样，检测发酵液在660 nm处的吸光度，绘制生长曲线。

2.2 碳源及添加量的确定

分别以5%的葡萄糖、红砂糖、乳糖、玉米粉和可溶性淀粉作为碳源添加至基础发酵培养基中，根据发酵情况确定优选碳源。然后分别将5.0%、10.0%、15.0%和20.0%的优选碳源添加至基础发酵培养基中，进行发酵。

2.3 氮源及添加量的确定

分别以2%的氯化铵、硫酸铵、磷酸氢二铵、尿素、柠檬酸铵、蛋白胨和酵母粉作为氮源添加至基础发酵培养基中，根据发酵情况确定优选氮源。然后分别将2.0%、4.0%、6.0%和8.0%的优选氮源添加至基础发酵培养基中，进行发酵。

2.4 碳氮源正交优化试验

根据碳氮源单因素试验结果，进行碳氮源正交优化试验，精确碳氮源的添加量。

2.5 发酵条件的优化

分别对发酵初始pH值（5.5、6.0、6.5和7.0）、装液量(50、75、100、125 ml/500 ml)、接种量（2.5%、5.0%、7.5%和10%）、振荡速率（0、75、150、180 r/min）和温度（24、27、30、33、36 ℃）进行单因素优化试验，确定最佳发酵条件。

3 结果与分析

3.1 酿酒酵母生长曲线

种子液中酿酒酵母的生长曲线（见图1A）表明，0～12 h为生长延滞期，12～24 h为生长对数期，24 h后为稳定期，确定22～24 h为最佳种龄。发酵液中酿酒酵母的生长曲线表明（见图1B），生长延滞期较短，发酵14 h后就进入了生长稳定期，确定16 h为最佳发酵时间。

图1 酿酒酵母生长曲线

3.2 碳源及添加量对发酵的影响

分别以葡萄糖、红砂糖、乳糖、玉米粉和淀粉为唯一碳源的发酵结果显示（见图2A），葡萄糖和红砂糖的发酵活菌数较高，而乳糖、玉米粉和淀粉的发酵活菌数极低。不同添加比例的葡萄糖发酵活菌数也不相同，其中10.0%葡萄糖发酵获得较高的活菌数（见图2B）。

图2 碳源及添加量对酿酒酵母发酵的影响

3.3 氮源及添加量对发酵的影响

分别以无机氮源（氯化铵、磷酸氢二铵、硫酸铵、柠檬酸铵和尿素）和有机氮（蛋白胨和酵母粉）为唯一氮源的发酵结果显示（图3A），蛋白胨和酵母粉有利于酿酒酵母的生长及增殖，活菌数较高；而无机氮源不利于酿酒酵母的生长及增殖，活菌数较低。蛋白胨添加量为4.0%时，发酵活菌数高于其它添加量（见图3B）。

图3 氮源及添加量对酿酒酵母发酵的影响

3.4 碳氮源正交试验结果

根据碳氮源单因素优化试验结果，以酿酒酵母发酵活菌数为指标，对葡萄糖、红砂糖、蛋白胨和酵母粉进行正交优化试验（试验设计见表1）。正交试验结果表明（见表2），从各因素对发酵活菌数影响的显著性上来看，蛋白胨＞葡萄糖＞酵母粉＞红砂糖；最佳组合为A3B3C1D2，即葡萄糖12.0%、红砂糖2.0%、蛋白胨3.0%、酵母粉1.0%。此培养基配方条件下，进行发酵验证试验，发酵液活菌数为5.01×108cfu/ml。

3.5 发酵条件的优化

3.5.1 初始pH值对发酵的影响(见图4)

由图4可以看出，不同初始pH值导致发酵活菌数不同，初始pH值为6.0时，发酵活菌数高于其它的初始pH值发酵活菌数，确定最佳初始pH值为6.0。

表1 碳源和氮源优化的正交试验因素和水平

表2 L9（34）正交试验结果

图4 初始pH值对酿酒酵母发酵的影响

3.5.2 装液量对发酵的影响(见图5)

图5结果显示，随着装液量的增加，发酵活菌数则降低，说明充分溶氧有利于酿酒酵母的生长及增殖；装液量分别为50 ml/500 ml和75 ml/500 ml时，发酵活菌数差异不显著，确定最佳装液量为75 ml/500 ml。

3.5.3 接种量对发酵的影响(见图6)

由图6可知，当接种量或大、或小时，都不利于酿酒酵母的生长及增殖。相较于其他接种量，5.0%的接种量可获得较高的活菌数，因此确定最佳接种量为5.0%。

3.5.4 振荡速率对发酵的影响(见图7)

图7结果表明，静置发酵最不利于酿酒酵母的增殖，随着振荡速率的提高，发酵活菌数也大幅提高；结合“3.5.2”试验结果，表明提高溶氧，有利于酿酒酵母的生长及增殖。确定最佳振荡速率为180 r/min。

图5 装液量对酿酒酵母发酵的影响

图6 接种量对酿酒酵母发酵的影响

图7 振荡速率对酿酒酵母发酵的影响

3.5.5 温度对发酵的影响(见图8)

由图8可以看出，发酵活菌数随着温度的升高，先升高后降低，在温度为30℃时，酿酒酵母活菌数达到最高，说明该温度为酿酒酵母最适生长温度，确定酿酒酵母的发酵温度为30℃。在初始pH值6.0、装液量75 ml/150 ml、接种量5.0%、振荡速率180 r/min、发酵温度30℃等最佳发酵条件下，进行发酵验证试验，发酵液活菌数为5.8×108cfu/ml，比优化前(2.0×108cfu/ml)提高了1.9倍。

图8 发酵温度对酿酒酵母发酵的影响

4 结论

本研究通过单因素试验和正交试验，对酿酒酵母的培养基和发酵条件进行了优化，结果表明，最佳发酵培养基为葡萄糖12.0%、红砂糖2.0%、蛋白胨3.0%、酵母粉1.0%、KH2PO40.1%、K2HPO41.0%、MgSO4·7H2O 0.1%、NaCl 0.1%。在初始pH值6.0、装液量75 ml/500 ml、接种量5.0%、振荡速率180 r/min、发酵温度30℃等条件下，酿酒酵母活菌数有了明显的提高，达到5.8×108cfu/ml，比优化前提高了1.9倍。