UPLC-MS/MS法同时测定金水宝胶囊中5种成分的含量

2015-01-19 06:02雍太萍华云鹏宗宁峰
中国医药导报 2015年36期
关键词:鸟苷胞苷腺嘌呤

雍太萍 华云鹏 宗宁峰 毕 慧 陆 瑜

解放军第四五四医院药学部,江苏南京 210002

金水宝胶囊主要成分是冬虫夏草分离纯化的虫草菌-蝙蝠蛾拟青霉CS-4 菌株, 经人工发酵培养加工而成[1-4]。该药具有补肾养肺、固精益气、增强免疫力之功效[5-10]。 临床上广泛用于治疗肺肾两虚、精气不足所致的咳嗽多喘、全身无力、失眠多忘、月经不调、腰膝酸软等[11-18]。

本研究旨在建立一种选择性好、快速简便的超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法同时测定金水宝胶囊中5 种成分的质量浓度, 为控制金水宝胶囊的质量提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 药品与试剂

金水宝胶囊(江西济民可信金水宝制药有限公司,批号:150422、150515、150616);标准品:腺苷(成都普瑞法科技开发有限公司,批号:13081813,纯度:99.2%)、胞苷(成都普瑞法科技开发有限公司,批号:13062509,纯度:98.9%)、鸟苷(成都普瑞法科技开发有限公司,批号:13091006,纯度:99.3%)、甘露醇(成都普瑞法科技开发有限公司,批号:13110812,纯度:99.5%)、腺嘌呤(成都普瑞法科技开发有限公司,批号:13120812,纯度:99.2%)。 其他相关试剂均为色谱纯。

1.2 仪器

Agilent 1290 超高效液相色谱仪(美国Agilent 公司);Agilent G6430 质 谱 仪,MassHunter 色 谱 工 作 站(美国Agilent 公司);Precisa XS225A 十万分之一分析天平;AnkeTDL-40B 离心机(上海科学安瓶科学仪器制造厂); 涡旋混合器ZH-2 (天津药典标准仪器厂);Drict-Q5 超纯水机(法国Millipore 公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

流动相:甲醇-0.1%甲酸水溶液(5∶95,V/V);色谱柱:Agilent ZOBAX SB C18(2.1 mm×150 mm,5 μm);流速:200 μL/min;柱温:35 ℃;进样量:2 μL。 采取自动进样方式。 离子化模式:正离子;定量模式:多反应监测模式(MRM);毛细管电压:4000 V;干燥气温度:400℃;腺苷的Fragmentor 及CE 值分别为100、20 V;胞苷的Fragmentor 及CE 值分别为100、10 V;鸟苷的Fragmentor 及CE 值分别为90、10 V; 甘露醇的Fragmentor 及CE 值分别为70、10 V; 腺嘌呤的Fragmentor 及CE 值分别为100、30 V; 检测对象: 腺苷m/z 268.1→m/z 136;胞苷m/z 244.2→m/z 112.1;鸟苷m/z 284.1→m/z 152.1;甘露醇m/z 183.1→m/z 69;腺嘌呤m/z 136.1→m/z 119.1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取标准品腺嘌呤、腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇适量,精密称定,用50%甲醇溶解并定容,制成腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤质量浓度分别为320、160、480、3200、320 ng/mL 的混合对照品溶液。依次进行倍比稀释,外标法定量分析。结果见表1。

表1 5 种化学对照品UPLC-MS/MS 分析浓度(ng/mL)

2.2.2 供试品溶液的制备 取金水宝胶囊内容物,研磨均匀,精密称取0.5 g,置于50 mL 容量瓶中,用90%甲醇溶解并定容,超声处理30 min(功率:45 kHz),摇匀,滤过。精密吸取上清液1 mL,置于100 mL 容量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,即得。按“2.1”项下条件进行测定,见图1。

图1 液-质联用离子流图

2.3 线性关系考察

使用“2.2.1”项下系列混合对照品溶液,按照“2.1”项下条件进行测定,以各化合物峰面积(Y)为纵坐标,相应浓度(X,ng/mL)为横坐标,进行线性回归,结果表明,腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤的质量浓度在相应范围内与峰面积呈良好线性关系。 见表2。

表2 金水宝胶囊中5 种成分的线性回归结果

2.4 精密度试验

取低、中、高3 个浓度(HB5、HB4、HB2)的混合对照品溶液分别重复进样5 次,按“2.1”项下条件进行测定,记录峰面积。结果腺苷的RSD 分别为3.1%、1.9%、2.8%(n=5);胞苷的RSD 分别为3.3%、3.2%、3.8%(n=5); 鸟苷的RSD 分别为2.4%、2.8%、1.9%(n = 5);甘露醇的RSD 分别为3.9%、4.1%、3.5%(n = 5);腺嘌呤的RSD 分别为4.1%、3.8%、3.5%(n = 5),实验结果符合中药质量标准分析方法的要求[19]附录130-131。

2.5 稳定性试验

取样品(批号:150515),按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,室温放置于进样室中,放置0、4、8、12、24 h时按“2.1”项下条件进样记录峰面积。 结果腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤峰面积的RSD 分别为3.5%、2.2%、2.6%、3.1%、3.1%(n = 5),结果表明供试品溶液在24 h 内稳定均较好。

2.6 重复性试验

取样品(批号:150515),共6 份,按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法,配制供试品溶液。 按“2.1”项下条件进测定,记录峰面积。结果腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、 腺嘌呤峰面积的RSD 分别为3.2%、3.4%、2.6%、2.8%、3.1%(n = 6),符合试验要求。

2.7 加样回收率试验

精密称定批号为150515 的样品约0.25 g,精密加入各对照品溶液适量,按“2.2.2”项下方法制备,依法测定并计算回收率。 结果见表3,实验结果符合中药质量标准分析方法的要求[19]824-825。

2.8 样品含量测定

取3 批金水宝胶囊,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下方法测定,计算每批金水宝胶囊中腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤的含量,结果见表4。

表3 加样回收率试验试验结果(n = 6)

表4 金水宝胶囊中5 个化合物含量测定结果(n = 3)

3 讨论

金水宝胶囊中的胞苷含量较低,紫外响应也较低,无法使用HPLC 法进行含量测定,同时,由于金水宝胶囊中化合物较多,不同成分之间相互干扰,这严重影响了相关成分的准确定量,故本实验最终选择分析速度快、灵敏度高的UPLC-MS/MS 法进行定量分析。

本试验也考察了不同色谱柱、流动相及质谱条件对化合物定量的影响, 结果表明,Agilent ZOBAX SB C18色谱柱(2.1 mm×150 mm,5 μm)效果较为理想,各化合物峰形良好,保留时间适中。 正离子模式下各化合物离子化效率高。 使用甲醇∶0.1%甲酸水溶液=5∶95时,各化合物分离较好,无相互干扰,出峰时间短。

2010 年版《中国药典》中金水宝胶囊仅采用HPLC测定其中腺苷的含量[19]824-825,而本研究采用UPLCMS/MS 法同时测定金水宝胶囊中腺苷、胞苷、鸟苷、甘露醇、腺嘌呤的含量,该方法具有干扰少、分析时间短、灵敏度高、专属性强的特点[20-23],为全面控制金水宝胶囊提供了可靠而简单的方法。

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