气相色谱—质谱法快速检测出口蔬菜中16种保鲜剂残留

周雪+曹淑瑞+李贤良+郗存显+徐芬+陈志琼

摘 要 采用分散固相萃取（QuEChERS）前处理方法结合气相色谱-质谱法（GC-MS）建立出口蔬菜中16种保鲜剂残留量的快速检测方法。以叶菜类、茄果类、豆类、瓜类和块茎类出口蔬菜为原料，样品经乙腈提取，QuEChERS除杂净化，用GC-MS外标法进行定量分析。16种保鲜剂在0.02～2.0 mg/L范围内线性关系良好，相关系数为0.9990～0.9997，检出限（LOD，S/N=3）在0.004～0.965 μg/kg范围内。以0.01， 0.02和1.0 mg/kg添加浓度水平进行方法学验证，回收率为76.7%～120.0%，相对标准偏差为2.1%～10.6%。与国标GB/T 19648-2006等方法相比，本方法具有快速、简便、灵敏度高等特点，能满足出口蔬菜中16种保鲜剂残留的检测要求。

关键词 分散固相萃取; 出口蔬菜; 保鲜剂; 气相色谱-质谱法

1 引 言

内陆蔬菜出口长距离运输易腐败变质^[1]，不规范使用或滥用蔬菜保鲜剂会导致保鲜剂超标。蔬菜保鲜剂主要分为天然保鲜剂和化学保鲜剂，由于化学保鲜剂价格低廉且易于操作，故在蔬菜储藏运输中应用较广^[2]。化学保鲜剂残留量过大，  不仅会影响出口蔬菜的质量，还可能严重影响消费者健康，有些保鲜剂甚至可能导致癌症及一些神经系统和生殖系统疾病的发生[3， 4]。众多的检测项目和较长的检测周期不仅给新鲜蔬菜收购、出口通关带来不便，还导致蔬菜保鲜品质下降。研发多种保鲜剂残留同时、快速、高灵敏度的分析方法，对提升出口蔬菜中保鲜剂残留的检测水平和加大监管力度起着重要作用。

常用的保鲜剂残留检测方法主要有免疫分析法^[5]、生物传感器^[6]、液相色谱法^[7]、液相色谱-质谱法^[8]、气相色谱法（GC）^[9]和气相色谱-质谱法（GC-MS）^[10]等。其中，GC的分离效能高、分析速度快，质谱则提供准确的结构信息，GC-MS已成为多种保鲜剂残留分析最为有力的方法之一。谢建军等^[11]采用GC-MS法对果蔬中嘧霉胺、百菌清、丙环唑、三唑酮等多种保鲜剂残留同时检测进行了报道。崔淑华等^[12]应用GC-MS法对果蔬中腈菌唑、丙环唑、三唑酮等保鲜剂在内的193种农药残留同时进行了检测。由于各种保鲜剂理化性质的差异性，同时检测多种保鲜剂残留的样品前处理方法需满足较宽范围的化合物，如直接对样品进行稀释或以固相萃取小柱进行净化，前者未能去除杂质，干扰较多;后者耗时较长，不利于通关放行。分散固相萃取是近年发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术， 该方法不仅能有效净化样品，还具有耗时短、操作简便、使用溶剂少等优点。

本研究对出口蔬菜中同时提取16种保鲜剂的溶剂进行了筛选，同时考察了乙酸铵缓冲溶液的作用，优化了分散固相萃取等净化条件，充分利用了GC-MS分离效率高、灵敏度高、专属性强的优点，建立了同时快速检测出口蔬菜中16种保鲜剂残留量的方法。本方法具有高的准确度和精密度，可为出口蔬菜中保鲜剂残留量的快速检测提供技术支持。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

7890-5975C气相色谱-质谱仪（美国Agilent公司）;BS224S型天平（德国Sartorius公司）;涡旋振荡混合器（江苏康健医疗用品有限公司）;3-30K台式高速冷冻离心机（德国 Sigma公司）;4011 Digital旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）;系列Eppendorf移液器（可调范围：10～100 μL，20～200 μL，10～1000 μL，1000～5000 μL，1～10 mL，德国Eppendorf公司）。

16种保鲜剂标准物质（纯度均≥99%，美国AccuStandard公司）;乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、甲苯（色谱纯，美国Tedia公司）;PSA（乙二胺-N-丙基硅烷，粒度60μm）、ODS（十八烷基硅烷键合硅胶、C18，粒度60 μm）均购于美国Agilent Technologies公司;C18固相萃取柱（6 mL，0.50 g）、活性炭固相萃取柱（6 mL，0.50 g）、NH2固相萃取柱（6 mL，0.50 g）、ENVI-CARB/LC-NH2固相萃取柱（6 mL，0.50 g）均购于美国SUPELCO公司;其它试剂均为国产分析纯;实验用水为Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）制备的超纯水;蔬菜均购于本地超市。

2.2 标准溶液配制

准确称取各标准物质0.01 g于烧杯中，加入少量丙酮，待完全溶解后，转移至10 mL 容量瓶中，并用丙酮定容，配制成1000 mg/L单标储备液。移取各个单标储备液，配制成20 mg/L混合标准溶液。储备液均置于 Symbolm@@ 18 ℃避光保存。储备液用丙酮逐级稀释，配制成系列工作溶液。

2.3 色谱-质谱条件

DB-5 MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;载气为高纯度氦气，流速1.2 mL/min;不分流进样，进样体积1 μL;进样口温度250 ℃;柱温程序：初温70 ℃，保持2 min，然后以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，总运行时间 28 min。离子源：EI源，电离能量70 eV;离子源温度：230 ℃;四级杆温度：150 ℃;接口温度：280 ℃;溶剂延迟：5 min。endprint

2.4 样品前处理

称取蔬菜匀浆10.0 g于50 mL螺旋盖聚四氟乙烯离心管，加入10 mL乙腈、4 mL 2 mol/L 乙酸铵溶液，涡旋振荡2 min，加入5.0 g NaCl，涡旋 1 min，5000 r/min离心3 min，取有机相。重复提取一次，合并有机相。取10 mL有机相于15 mL螺旋盖聚四氟乙烯离心管中，加入100 mg PSA、150 mg ODS、500 mg 无水MgSO4，涡旋1 min，以5000 r/min离心3 min，取上清液于25 mL旋蒸瓶中，在低于40 ℃下旋转蒸发浓缩至净干，用丙酮定容至1 mL，经0.22 μm滤膜过滤至气相进样瓶中，待GC-MS测定。

3 结果与讨论

3.1 样品前处理条件的优化

3.1.1 提取剂的选择 由于16种保鲜剂极性存在一定差异性，因此选用常用的丙酮（AC）、丙酮-乙酸乙酯（AC-EAC，1∶1， V/V）、正己烷-乙酸乙酯（Hex-EAC，1∶1， V/V）、乙腈（AN）分别进行加标回收实验，以选取合适的提取溶剂。结果如图1（未加入乙酸铵缓冲溶液调pH值）所示，乙腈的提取回收率相对较好，故实验采用乙腈作为提取剂。

对羟基苯甲酸酯类保鲜剂显弱酸性，调节溶液pH值，使组分处于分子状态，易被有机溶剂萃取，基于上述原理，考虑加入乙酸铵缓冲溶液调节溶液的pH值。文献[13]报道，加入2 mol/L 乙酸铵缓冲溶液后，对羟基苯甲酸酯类保鲜剂的回收率增大，且对其它保鲜剂的回收率没有影响。本实验对2 mol/L 乙酸铵溶液加入体积（0， 2， 4， 6和10 mL）进行了考察，当乙酸铵溶液的加入体积为4 mL时，对羟基苯甲酸酯类保鲜剂的回收率最佳，故本实验在提取过程中加入4 mL 2 mol/L乙酸铵缓冲溶液。

3.1.2 净化条件的选择

在QuEChERS文献报道中，主要使用PSA， ODS和GCB吸附剂[9， 11， 14， 15]对提取液进行净化，GCB虽然能够有效去除色素，但也会使多酚类和其它极性化合物回收率过低，故拟选用PSA、ODS达到好的净化和回收效果。本实验通过加标回收实验确定吸附剂用量，以甘蓝为基质，各保鲜剂的添加水平均为0.05 mg/kg，当ODS用量不变，PSA的用量分别为0， 50， 100， 150和200 mg时，净化结果见图2。当PSA用量为100 mg时，16种保鲜剂的回收效果较好。

当PSA用量为100 mg时，改变ODS 用量（0， 50， 100， 150和200 mg），各保鲜剂的回收率相差不大，故对各水平ODS净化后的甘蓝空白样品谱图进行重叠分析，见图3。根据质谱信息，残留量较多的杂质分别是N， N′-二乙基草酰胺、苯胺、5-乙酯基氨基-8-甲氧基喹啉。由图3可见，150 mg ODS对苯胺的净化效果最好，原因可能有3个方面：（1）非极性相互作用：苯胺的母核苯基与非极性吸附剂ODS之间的作用力，这种作用力在极性溶剂乙腈中有较好的体现，也称疏水作用;（2）ODS颗粒表面残留的硅羟基会与极性化合物苯胺发生次级相互作用，即发生氢键作用;（3）硅羟基解离后会和碱性化合物苯胺发生离子相互作用。ODS对N， N′-二乙基草酰胺的净化作用不好，N， N′-二乙基草酰胺极性很强，故不存在非极性相互作用，推测非极性相互作用起主导作用。50 mg ODS对5-乙酯基氨基-8-甲氧基喹啉净化效果最好，喹啉的极性很小，非极性相互作用起主导作用。综合考虑，ODS用量定为150 mg。

在传统实验中，若浓缩时溶剂较少，通常采用氮气吹干方式。由于本实验提取溶剂选用乙腈，采用氮气吹干方式耗时较长，故采用旋转抽干模式进行浓缩。实验表明，两者的回收效果相当，故采用旋转抽干模式以提升实验效率。

3.2 与其它方法进行对比

将本方法与GB/T 19648 2006^[14]、GC-MS联用测定果蔬中6种防腐杀菌剂检测方法 [16]以及EN 165662-2008^[15]进行了比较。GB/T 19648 2006采用净化方式，先经C18固相萃取柱，再经活性炭固相萃取柱和NH2固相萃取柱串联柱净化;而文献[16]未经过净化。实验结果表明，采用国标方法的净化方式， 对羟基苯甲酸酯、联苯醚的回收率不及本方法，且耗时过长，实验效率低;文献[16]所用时间少，回收率也相对较好，但杂质多，对仪器的损伤很大，且会对回收率造成假阳性。本方法采用了欧盟EN 165662-2008^[15]的QuEChERS净化方法，但是在提取过程中加入了乙酸铵溶液，且采用ODS净化，更利于16种保鲜剂的同时提取和净化处理。结果见表1。

3.3 线性关系、标准曲线以及检出限

用丙酮将标准储备液逐级稀释成浓度为0.02～2.0 mg/L系列标准工作溶液，在设定的仪器条件下进行测定。以目标物定量离子的峰面积对相应的质量浓度（mg/L）绘制标准曲线，16种保鲜剂在0.02～2.0 mg/L范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.999。以3倍S/N计算16种保鲜剂的检出限。通过仪器分析目标物的质谱图并结合文献，确定各化合物的特征离子。16种保鲜剂的保留时间、选择离子、标准曲线、相关系数以及检出限见表2。

3.4 方法的回收率与精密度

分别向甘蓝、黄瓜、四季豆、茄子、胡萝卜等多种蔬菜匀浆中添加不同浓度的16种保鲜剂混合标准溶液，添加水平分别为0.01，0.02和1.0 mg/kg，按2.4节所述实验方法进行测定。以茄子为例，各保鲜剂的平均回收率在76.7%～120%范围内;RSD在2.1%～10.6%范围内（表3）。endprint

3.5 实际样品检测

从本地超市购得甘蓝、白花菜、藠头及辣椒等蔬菜，按照本实验选择的最优条件进行提取净化和分析，结果见表4。虽然在部分蔬菜中检出部分保鲜剂，但其含量均未超过国家规定的蔬菜保鲜剂最高残留量。

结果表明， 本方法在提取溶剂中加入乙酸铵溶液，有利于对羟基苯甲酸酯的提取，用PSA、ODS进行了QuEChERS净化。与其它保鲜剂多残留分析方法相比，本方法具有操作方法简单、分析时间短、准确度高等优点，能为出口蔬菜的快速通关提供技术保障。

References

1 PanstrugaR，  Schulze-Lefert P. Microbes and Infection，  2003，  5（5）： 429-437

2 ZHOU Xue，  CAO Shu-Rui，  LI Xian-Liang，  XI Cun-Xian，  XU Fen，  CHEN Zhi-Qiong. Journal of Anhui Agri. Sci.，   2014，  42（17）： 5614-5616

周 雪， 曹淑瑞， 李贤良， 郗存显， 徐 芬， 陈志琼. 安徽农业科学，  2014，  42（17）： 5614-5616

3 Kirkhorn S R，  Schenker M B. J. Agr. Safety Health，   2002，  8（2）： 199-214

4 Costa L G，  Cole T B，  Jarvik G P，  Furlong C E. Annu. Rev. Med.，   2003， （54）： 371-392

5 GUO Nai-Fei，  YU Ji-Cheng，  JI Shu-Juan. Science and Technology of Food Industry，   2010，  （3）： 409-413

郭乃菲， 于基成， 纪淑娟. 食品工业科技，  2010，  （3）： 409-413

6 CesarinoI，  Moraes F C，  Lanza M R V. Food Chem.，   2012，  135（3）： 873-879

7 ProusalisK P，  Polygenis D A，  Syrokou A，  Lamari F N，  Tsegenidis T. Anal. Bioanal. Chem.，   2004，  379（3）： 458-463

8 ZHANG Hui，  HU Mei，  WANG Jun，  ZHANG Xi-Qi，  ZHU Jian-Hua. Food Chem.，   2009，  30（2）： 180-184

张 卉， 胡 梅， 王 俊， 张喜琦， 祝建华. 食品科学，  2009，  30（2）： 180-184

9 ZHU Li-Ping，  ZHU Tao，  PAN Yu-Xiang，  SUN Jun，  DONG Jing. Chinese J. Anal. Chem.，   2008，  36（7）： 999-1003

朱莉萍， 朱 涛， 潘玉香， 孙 军， 董 静. 分析化学，  2008，  36（7）： 999-1003

10 Cerbera M I，  Medina C，  Portolés T，  Pitarch E. Anal. Bioanal. Chem.，   2010，  397（3）： 2873-2891

11 XIE Jian-Jun，  CHEN Jie，  LI Ju，  YUAN Zhen-Yu，  XIE Yu-Shan. Journal of Food Safety and Quality，   2013，  4（1）： 82-88

谢建军， 陈 捷， 李 菊， 袁震宇， 谢玉珊. 食品安全质量检测学报，  2013，  4（1）： 82-88

12 CUI Shu-Hua，  CHEN Wei-Shuang，  QIAN Jia-Liang，  DUAN Hao，  LIU Tong-Ying，  ZHANG Li-Dong. Chinese Journal of Chromatography，   2013，  9（31）： 885-893

崔淑华， 陈慰双， 钱家亮， 段 浩， 刘同英， 张立东. 色谱，  2013，  9（31）： 885-893

13 CAO Shu-Rui，  LIU Zhi-Yong，  ZHANG Lei，  LI Xian-Liang，  WANG Guo-Min，  TANG Bo-Bin，  YUAN Ruo. Chinese J. Anal. Chem. ，   2012，  40（4）： 529-533endprint

曹淑瑞， 刘治勇， 张 雷， 李贤良， 王国民， 唐柏斌， 袁 若. 分析化学，  2012，  40（4）： 529-533

14 GBT 19648-2006，  Method for Determination of 500 Pesticides and Related Chemicals Residues in Fruits and Vegetables-GC-MS Method. National Standards of the People′s Republic of China

水果和蔬菜中500种农药及相关化学品残留骨的测定 气相色谱-质谱法.中华人民共和国国家标准.GBT 19648-2006

15 EN 165662-2008，  Foods of Plant Origin-Determination of Pesticide Residues Using GC-MS and/or LC-MS/MS Following Acetonitrile Extraction/Partitioning and Cleanup by Dispersive SPE-QuEChERS-Method. EUROPEAN STANDARD

16 JIN Zhi，  LI Ming，  YANG Tao，  ZHAHG Huang-Tao. Xinjiang Agricultural Science，  2010，  47（8）： 1693-1696

靳 智， 李 明， 杨 涛， 张煌涛. 新疆农业科学，  2010，  47（8）： 1693-1696

Gas Chromatography-Mass Spectrometry Method for Rapid Detection

of 16 Preservative Residues in Vegetables for Export

ZHOU Xue1， CAO Shu-Rui2， LI Xian-Liang2， XI Cun-Xian2， XU Fen2， CHEN Zhi-Qiong*1

1（College of Pharmacy， Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）

2（Chongqing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Chongqing 400020， China）

Abstract A rapid detection method of 16 preservative residues in vegetables for export was developed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） after pre-treatment method of dispersive solid phase extraction （SPE）. Samples including leafy， eggplant fruit， bean， melon and tuber vegetables were extracted with acetonitrile and detected by GC/MS with external standard method after being cleaned up with dispersive SPE. The results showed that the method had a good linearity over concentration range of 0.02-2.0 mg/L preservatives with correlation coefficients of 0.9990-0.9997. The limits of detection （LODs） were in the range of 0.004-0.965 μg/kg. The recoveries of the preservatives were in the range of 76.7%-120.0% at the spiked levels of 0.01， 0.02 and 1.00 mg/kg， and the relative standard deviations （RSDs） were in the range of 2.1%-10.6%. Compared with the GB/T 19648-2006， etc， the method is rapid， simple， highly sensitive， and can meet testing requirements of 16 preservative residues in vegetables for export.

Keywords Dispersive solid phase extraction; Vegetables; Preservative; Gas chromatography-mass spectrometry

（Received 24 July 2014; accepted 24 September 2014）endprint